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        化学法

        最新修订时间:

        原理

        感受态是受体最容易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态,用对应化学物质处理细胞后,细胞逐渐形成感受态细胞并进行转化。化学法简单,快速,稳定,重复性好,广泛用于外源基因的转化。

        材料与仪器

        步骤

        一、试剂与耗材

        1.  试剂
         
        细菌用-酵母提取物(Fisher)、 细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
         
        2.  仪器
         
        水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30℃摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

        二、 试剂配方
         
        1.  YPDA液体或固体培养基
         
        (1)1%酵母提取物: 10 g/L
         
        (2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
         
        (3)2%葡萄糖:20 g/L
         
        2.  转化液
         
        (1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 ul
         
        (2)1 M醋酸锂:36 ul
         
        (3)SsDNA(10 mg/ml):10 ul
         
        (4)质粒:3 ul
         
        (5)总计:360 ul
         
        3.  YNB+ MA 培养基(100 ml)
         
        (1)YNB:0.67 g
         
        (2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
         
        (3)腺嘌呤:0.01 g
         
        (4)琼脂粉:2g
         
        (5)葡萄糖:2g
        三、制备步骤
         
        1.  在转化实验的两天前,于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。
         
        2.   转化前一天,挑取活化的酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中,30℃,200 rpm培养过夜。
         
        3.  将培养过夜的酵母细胞液按1:3的比例转接与新的YPDA液体培养基中,于30℃摇床内,200 rpm培养4 h。
         
        4.  3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞,用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。
         
        5.  再次3 000 g 离心 5分钟。
         
        6.  用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞,并转入适宜的离心管中,20℃,3 000 g 离心 5分钟。
         
        7.  用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。
         
        8.  将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。
         
        9.  将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率)。
         
        10.  将装有酵母细胞的盒子放入-80℃冰箱。(细胞在-80℃能够保存一年以上)。
         
             

        常见问题

        一、化学法试剂配方:

        1.  YPDA液体或固体培养基

         

        (1)1%酵母提取物: 10 g/L

         

        (2)2%胰蛋白胨: 20 g/L

         

        (3)2%葡萄糖:20 g/L

         

        2.  转化液

         

        (1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl

         

        (2)1 M醋酸锂:36 μl

         

        (3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl

         

        (4)质粒:3 μl

         

        (5)总计:360 μl

         

        3.  YNB+ MA 培养基(100 ml)

         

        (1)YNB:0.67 g

         

        (2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g

         

        (3)腺嘌呤:0.01 g

         

        (4)琼脂粉:2g

         

        (5)葡萄糖:2g


        、参考文献
         
        1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
         
        2.   Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.

        来源:丁香实验

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