PCR法检测支原体

2. 模板的制作：在无菌的条件下，取细胞培养上清液100μl于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95℃水浴加热5min。

3. 打开盖子，向管内加StrataClean树脂10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5——10s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4℃保存。

4. PCR反应：

反应体系最适条件为：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.38），50mmol／L KCl，1.5——2.5mmol／LMgCl₂，200 μmol／L dNTP，2U Taq DNA聚合酶；总反应体系为50μl，反应用去离子水均需用12000μJ／cm²紫外灯照射。

（1）在0.5ml塑料离心管中加入35.2μl去离子水及5μl 10×Taq反应缓冲液。

（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP（25mmol／L）；0.4μl Taq酶（5U／μl）；2μl引物。

（3）加2μl去离子水，总体积45μl。

（3）加2μl去离子水，总体积45μl。

（4）加5μl已制成的模板到反应体系中。

（5）阳性对照、内对照各5μl加入到各自的反应体系中。

（6）取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl去离子水作为阴性对照管。

（7）在反应体系中加入100μl矿物油。

（8）PCR程序

程序1：    94℃ 2min、50℃ 2min、72℃ 2min，1个循环；

程序2：    94℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min，共40个循环。

5. 琼脂糖凝胶电泳：PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度2％。电泳结束后，凝胶成像分析结果。

6. 实验结果及分析：

该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上，Marker（DNA分子质量标准参照物）、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带。当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和阴性对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2种以上支原体所致。

1. PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。

2. 检测前，待测细胞要用无双抗培养基培养7d。