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        PCR法检测支原体

        互联网

        19286

        PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增技术,其基本原理是酶促DNA合成反应,即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA聚合酶的作用,使DNA 链扩增延伸。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点,但其对实验环境的要求严格,实验成本较高,有时还有假阳性的现象出现。

        1、仪器设备

        超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混悬器等。

        2、实验试剂

        选用美国Stratagene公司生产的支原体检测试剂盒(内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean resin、缓冲液),dNTP,TapDNA聚合酶,缓冲液,琼脂糖,矿物油。

        3、实验操作

        PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。

        (1)样品的收集:待测细胞用无双抗培养基培养7d,用无菌容器取上清液500ul,4℃保存待测。

        (2)模板的制作:在无菌的条件下,取细胞培养上清100ul于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子,95℃水浴加热5min。

        (3)打开盖子,向管内加StrataClean resin10ul,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5—10s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕,4℃保存。

        (4)PCR反应:反应体系最适条件为:10mmol/lTris-HCL(pH8.38);50mmol/lHCL;1.5-2.5mmol/lMgCL2;200umol/ldNTP;2UDapDNA聚合酶。总反应体系为50ul,反应用去离子水均需用12000uw/cm2紫外灯照射。反应如下表:

        表 反应程序

        程 序 循 环 温度/℃ 时间/min
        94 2
        1 1 50 2
        72 2
        94 1
        2 40 50 1
        72 2


        ①在0.5ml塑料离心管中加入35.2ul去离子水及5uundefined10Taq反应缓冲液。

        ②依次加入下列成分:0.4uldNTPs(25mmol/l),0.4ulTaqDNA聚合酶(5U/ul),2ul引物。

        ③加2ul去离子水,总体积45ul。

        ④加2ul已制成的模板到反应体系中。

        ⑤阳性对照,内对照各5ul加入到各自的反应体系中。

        ⑥取一支含有以上反应体系的离心管,加入5ul去离子水作为阴性对照管。

        ⑦在反应体系中加入100ul矿物油。

        (5)琼脂糖凝胶电泳:PCR反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。

        (6)结果分析:该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上,MARKER、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带,当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和阴性对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染两种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现,则可怀疑有支原体污染,重做该样品。

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