遗传学实验

对于逆病毒转导的肌肉细胞或者D N A 疫苗肌肉都是很好的打靶位置。这两种方法我们都在这里进行描述。

利用这一单元的操作方案，可采用外科手术的方法直接将载体（病毒或非病毒）或已转导基因的内皮细胞或平滑肌细胞注入到正常的或已损伤的动脉中。选择动脉基因转移需要考虑：动物种类的选择、动脉的位置、载体（包括调控序列）、手术方法的选择以及选择损伤的动脉还是没有损伤的动脉。在本节所介绍的方法适合于病毒和非病毒载体的转移；第一个操作方案能用于转移已稳定转染了基因的内皮细胞和平滑肌细胞。

用于组织培养物中的细胞的脂质体转染的许多阳离子脂质体都能够购买得到。成分优化高度依赖细胞类型，而与在进行体内转染相对应组织时，典型的优化的成分不相关。所以，对于体外的转染，建议读者在说明书的指导下测试不同的商业脂质体。

通过同源重组，许多带有部分或全部 HSV-1 基因组的 cos 质粒可以形成环状复制型的病毒，产生感染性的病毒颗粒。但是，如果 DNA 的剪切/包装信号（pac) 缺失，重组的病毒基因组就不能够进行包装，但在辅助病毒作用下仍能形成可共转染的复制型 DNA。这些包装好的复制型 DNA 可以不依赖于辅助病毒。

反转录病毒假包膜的定义是一个病毒的基因组被第二个病毒的包膜蛋白壳体化。假包膜的宿主范围是由产生包膜蛋白的病毒决定的。正因为依赖于包膜蛋白，因此，假包膜形成既能伸展也能或限制亲本反转录病毒的宿主范围。

对有关最新的腺相关病毒载体（AAV ) 的构建方法做了说明。野生型的腺相关病毒在人体中并不存在，在某些系统中，腺相关病毒可以整合到被感染细胞的基因组中从而使得转基因在生物体内长期表达。但是，怎样获得高浓度的辅助载体和病毒载体相独立的腺相关病毒载体一直以来是个难题。Samulsk1 和他的同事们提出的一种基于质粒的体系为解决这一难题迈出了重要的一步。

如若实验者所感兴趣的基因与穿梭载体没有准确配置的限制酶酶切位点，就必须通过 T4DNA 聚合酶将一方或双方的限制性酶切位点平末端化。有些情况下，可能通过连接酶或 PCR 扩增的方法来导入新的限制性酶切位点更为方便。而 PCR 的方法显得快捷而有效，但其扩增的基因必须通过测序证实。

描述了 cDNA 芯片在人类基因表达分析中的用途。制备 cDNA 芯片的方法之一是用一个特制的打印机将扩增的 cDNA 转移至显微镜载（玻）片上。标记 cDNA 探针的制备以及与芯片的杂交也有所描述。

介绍了用于表达调控研究的 mRNA 的准备，包括制备、纯化和定量标记用于寡核苷酸分析的 cDNA 探针的方法。本单元还描述了几种处理和标准化基因表达原始数据的方法，以用于聚类分析和进一步的分析。

用 PCR 来分析 DNA 甲基化的方法可以运用于：（1）对基因组中任何位置的 CpG 甲基化的分析；（2）检测肿瘤患者的基因改变以及介人被印的基因的固定遗传障碍的研究。

最新的证据表明恶性进展是受损基因的累积造成的，它是一个多阶段的过程。可以想像，研究这些变化将有助于癌的诊断，而且最终会为发现更为特异性的治疗方案提供线索。

克隆抗原受体重组出现于大多数淋巴瘤细胞，因此该标记被用于第 1 步淋巴组织活检。易位则用于第 2 步检查，对肿瘤进行分型。对于组织学和其他结果预示有特殊移位存在的情况可以直接检测易位。抗原受体重组不适用于大多数非淋巴细胞白血病，在这些病例中染色体易位是唯一适合的分子标记。

本章讲到了收获分裂中期细胞的方法和对实体瘤培养物进行染色体分析的方法。这些方法在鉴别组织学上非常相似的肿瘤（如 Ewing 肉瘤和成神经细胞瘤）方面非常有效。随着技术的改进，实体瘤的细胞遗传学分析有望在临床上发挥更大的作用。

这个单元描述的特殊的基因位点的所有分析也许会使用 PEP，因为扩增的第一步比 PCR 的主要部分更重要。可是有些分析并不需要 pEp，这些也许是很重要 PCR 部分。只有观因子基因（血友病）和 DMD 基因包括 PEP 在内使用这个分析的一'部分。

在线粒体和核 DNA 中，遗传或自发出现的突变可引起氧化磷酸化（OXPhOs) 疾病。现今，17 种线粒体 DNA 的突变被病理生物学所证实，幻种突变也被临时证实 (Wallace et al.,1995)。OZPHOS 疾病诊断的复杂性、mtDNA 突变的选择和特异性组织的分析都属于这一单元的内容。具体的讨论参考 Shoffner 和 Wallace(1995)。

对CGG重复片段的PCR分析要比Southern分析（基本方案2)快，且能够准确确定正常片段（6~45次重复）、中间状态（45~55次重复）及前突变单体情况（55~200 次重复)。PCR同时也能够检测出各世代间重复次数的小的改变。在PCR反应中用7-deaza-2'-dGTP代替dGTP可以完成常规PCR反应无法完成的全突变（>200次重复）的扩增。

本法的显著优点在于 ASO 探针只需注意两个参数：①同一个探针池中所有 ASO 探针长度一致（本方案中优化的 ASO 探针长度为 17 个碱基对）；②寡核苷酸探针和目标序列的错配单碱基位置不可位于 ASO 探针的末端（本方案是基于单个错配碱基位于距离 ASO 探针 5'端 5~7 个碱基对）。

范可尼贫血 (farnxmianemia，FA) 是一种常染色体隐性综合征，其临床特征表现为进行性骨髓衰竭和恶性肿瘤的患病风险增加，尤其是急性骨髓性白血病和鳞状上皮细胞癌。

采用经典细胞遗传学方法对羊水细胞做出遗传学诊断需要 7~12d 时间，而采用间期核 FISH 方法对间期核进行分析则可在 48d 内检测出特殊的染色体非整倍体。FISH 操作程序中所列出的是间标检测法，但也可采用直接标记 DNA 探针的直标法。

病理检查对组织的处理大部分是采用福尔马林固定和石蜡包埋。这些石蜡包埋块可存放至少 20 年，这为进一步研究和发现潜在的有用信息提供了原材料。一般情况下这里给出的技术方法对于福尔马林或多聚甲醛固定组织效果是很好的。其他一些固定剂 (如乙醇）也可以采用，但有些固定剂（如 Zenker) 效果欠佳。