DNA 实验

差减克隆是分离和鉴定两个细胞群中差异表达的 mRNA 的有效技术。相比较的细胞类型是［＋］（或 测 试）细胞和［-］（或驱动）细胞，在测试细胞中表达而不在驱动细胞中表达的 mRNA 将被分离出来。必需的差减次数主要取决于 cDNA 的多样性。多样性是指每一个细胞类型中不同的cDNA 或 cDNA 片段的总数（Davidson， 1986）。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版）》

差减文库包含了存在于一种细胞或组织而不存在于另一种细胞或组织的 mRNA cDNA 克隆。这个 cDNA 文库被用来分离相应于一类 mRNA 的一组 cDNA 克隆，或用 于分离一个特定mRNA 的 cDNA 克隆。这中间筛选 cDNA 克隆的过程是很费劳力的。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版）》

测定每个固定化 cDNA 点上荧光度的比值，人们得以度量一个样品库中信使与另一个库中信使的相对比值。如果一系列的样品都与一个共同的参照比较的话，所有样品中信息的相对量就可以作比较，得出它们之间的相似和差异。来源：《精编分子生物学实验指南 第五版》

基因置换是酵母研究中最有效和最重要的技术之一。这种技术能使一个在染色体正常位置的基因与其离体条件下构建的等位基因进行置换，使置换前后的菌株仅仅在这个特殊的等位基因上存在遗传差异。利用这种方法可以分析在基因克隆中由无效突变 (null mutationr) 或其他任何类型突变所引起的表型变化。无论在理论上或在实践中，一个被克隆的酵母基因均有可能发生突变，然后通过重组进入基因组，从而精确的置换野生型等

染色体畸变通常在大多数血液肿瘤和各种实体瘤中检测到，在临床病理上，经常与判定肿瘤的直接形态和免疫表型特征有关。染色体畸变的检测为逐条诊断和肿瘤遗传分类奠定了基础。尤其在白血病和淋巴瘤中，许多主要的染色体畸变与疾病的临床分期有关。另外，在肿瘤预后过程中，还将发生其他染色体的畸变。因此，细胞遗传学结果对预后估计和选择治疗方案有很大帮助。

比较基因组杂交（CGH) 可以提供肿瘤细胞全基因组染色体拷贝数改变的信息 [1]。与常规细胞遗传学分析不同，CGH 无需细胞培养，因此只要是可以获得 DNA 的临床标本，包括存档的石蜡包埋组织，都可以进行该实验 ra。CGH 可以在正常染色体上定位扩增或缺失的 DNA 序列，从而显示出重要基因的位点。但是，CGH 由于自身分辨率的限制不能检测出亚染色体的改变，也不能检测染色体结构的改变，如染色体易

基因扩增经常在人肿瘤细胞中被检测到并在肿瘤发生中起重要的作用。用比较基因组杂交对肿瘤细胞进行全基因组扫描，揭示出在实体肿瘤基因组的许多区域有基因拷贝数的改变。对改变区域 DNA 的深入研究显示在实体瘤中复杂的 DNA 重排涉及多个基因并跨越几个 Mb。在染色体倍体变化中，经常伴有基因重排。尽管研究 DNA 扩增区域有可能发现新的与肿瘤发生相关的基因，但在这些大的复杂重排中，邻近基因的共同扩增比较复

荧光原位杂交（FISH) 技术能够快速检测各种组织，包括新鲜和存档标本中的染色体异常。这些技术已经为临床细胞遗传学和研究机构所广泛接受。然而，这些方法却并非常用于非细胞遗传学诊断的病理学服务，部分是因为 FISH 图像设备不能普遍地为负责组织学诊断的诊断医生（外科病理学家）所用。因此，各种原位杂交探针和检测方法的改进令人满意，尤其是过去的 5 年，已经可以通过光学显微镜，以酶学原位杂交来进行常规分

本章的目的是应用荧光原位杂交来研究慢性髓细胞性白血病（CML) 患者的间期核。根据我们的经验，FISH 用来检测 BCE/ABL 融合形成的所有形式的费城（Ph) 染色体 FISH 是常规细胞遗传学研究有价值的辅助手段并且能够应用于同样的标本。因为 FISH 可以用来对增殖的肿瘤细胞中期分裂相和非增殖的间期细胞进行定量研究，这对用外周血或骨髓来评价治疗效果特别有用。本章讨论了用BCR 和 ABL

荧光原位杂交（FISH) 包括荧光素标记的特异性探针与患者染色体 DNA 杂交，并用荧光显微镜检测信号。FISH 不仅能用于中期染色体，也可用于间期核的诊断，因此不需要培养细胞进行诊断。FISH 作为一种在临床细胞遗传学中很有潜力的诊断技术，在大约 15 年前问世。已经证实：用特异性探针 FISH 检测间期核的染色体数目非常快捷有效。

种间彩色显带技术是一种简单快速地检测用 G 显带无法识别的染色体异常的方法。当 GTG 显带不能给单条染色体涂染探针分析提供足够线索时，该技术尤其有用。另外，彩色显带技术能够检测染色体内部的异常，如倒位、重复和用其他多重 FISH 技术（如 M-HSH 和 SKY) 不能检测到的微小缺失。

M-FISH 被成功地用于鉴别先天性疾病中的标记染色体或衍生染色体。近来该方法越来越多地被用于确认复杂核型中的多重染色体异常；在进行血液疾病的诊断时，M-FISH 在检测临界染色体重排中非常有用

引物介导的原位标记技术（primed in situ labeling，PRINS) 是一种对细胞及组织的特异 DNA 序列染色的杂交技术，它能够得到和 FISH 技术相同类型的结果。

在近几十年中众所周知的是：在大部分人类肿瘤 和某些特定人类遗传病中存在染色体重排。肿瘤特定的染色体异常会导致原癌基因产物的激活、肿瘤特异融合蛋白的产生或肿瘤抑制基因的失活。自从染色体显带技术建立以来，肿瘤非随机性染色体异常的细胞遗传学分析已成为许多人类肿瘤诊断和预后不可或缺的指标 ，但常规显带染色体分析不能确定所有的细胞遗传学染色体重排（如复杂的染色体重排、小环状染色体和不能鉴别的新出现的非平衡性

荧光原位杂交（FISH) 技术可以对染色体、细胞和组织中的特异核酸序列进行检测。明确检测到全染色体或染色体某个特定区域的结构或拷贝数发生改变是人类疾病重要的预兆因子。应用于染色体分析的 FISH 可以分为中期 FISH 和间期 FISH，两者的主要区别在预处理和杂交前的细胞制备工作。用于中期分析的细胞培养方法与标准核型分析的细胞培养相同。FISH 在细胞结构较少或者含有不同种群细胞的标本中最有效。

作者已经有办法检测 HSV-IIE 基因功能并继而通过同源重组把外源基因引入 HSV-I 基因组。由于有些 HSV-IIE 基因—转染细胞蛋白 4(ICP4) 和 27(ICP27)—对所培养细胞的生长是很必要的，反向表达这些基因产物以补足细胞系对于分离和繁殖复制缺陷型病毒突变体是很有必要的。

这一章描述的实验方法是基于我们关于来自S N V 及其紧密相连的R E V -A 载体的实 验 （P a r v e e n e t a L 2000)。我们曾用这两种病毒载体对各种细胞进行基因转移，包括初期的造血细胞、人脑及有丝分裂后的神经元细胞（Parveen etal.2000)。与其他反转录病毒载体相同，基 于 S N V 载体系统的三个主要元件是：①包装信号序列（恥 ，以确保载体R N

无论是鉴别常染色体显性异常的病理学突变还是鉴别常染色体隐性和 X 连锁的携带者，其最终的关键步骤是在序列级别上识别其突变。另外，对快速增长的单核苷酸多态性（SNP) 方面搜集的资料的鉴别需要一种对杂合子序列变异进行鉴别的方法。这种鉴别现在正被用于大量人口复杂遗传性状的研究。

单链构象多态性（SSCP) 是最常用的突变检测方法之一。应用毛细管电泳法，通过 DNA 在非变性聚合物中被分离，可以区分野生型和突变型 DNA 片段。通过给每条链贴上不同的标签可以区分两条链。构象是蕰度决定的，因此，凝胶电泳时要在不同的温度下以实现一个高敏感性。

BAC (Bacterial Artificial Chromosome，细菌人工染色体)文库可用于：（1）全基因组测序；（2）构建物理图谱、染色体步查；（3）基因筛选；（4）基因图位克隆。