YJ205 HA免疫(共)沉淀试剂盒

HA免疫(共)沉淀试剂盒 
HA IP/Co-IP Kit
本产品 4℃运输；保存于 4℃，其中 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 (5×) 需 -20℃保存，保质期 12 个月，Anti-HA免疫磁珠 严禁冻结，长期存放请保证试剂管竖立向上，磁珠浸没于保存液中。

货号规格
goodYJ205    ≥40次

产品简介

good本产品能够高效完成抗原免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验，其核心成分 Anti-HA 免疫磁珠采用新一代纳米表面生物技术，将鼠源单克隆 Anti-HA 抗体高密度共价偶联在超顺磁性纳米微球表面，是纯化HA 标签蛋白的理想工具。与市场上同类产品相比，其具有更大的特异性表面区域，非特异性结合率低，使用起来简便高效，可有效避免长时间操作造成目标蛋白被水解，确保了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。
good此外，本试剂盒中配有经过优化预制的各种缓冲液，为免疫(共)沉淀实验提供了合适的反应条件，增强了实验的稳定性，可应用于多种样品，细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等均可适用。

产品内容
 

操作步骤
good◆ 样本处理
good◆gg1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
good◆ 样1. 根A. 血清样品：若目标蛋白丰度较高，建议用 裂解/漂洗缓冲液 稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根B. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10 µL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20 min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根C. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150 µL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5 mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30 µL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20 min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根D. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12,000×g，2 min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10 mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10 mL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12,000~16,000×g，10 min)。

good◆ 磁珠预处理
good◆gg2. 用移液器轻柔吹打 Anti-HA免疫磁珠 ，使其充分混悬，取25 µL磁珠悬液置于1.5 mL 离心管中；
good◆gg3. 加入500 µL 裂解/漂洗缓冲液 ，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
good◆gg4. 重复步骤3两次；

good◆ 样品的结合
good◆gg5. 在预处理后的磁珠中加入500 µL步骤1制备好的样品，置于翻转混合仪上孵育(常温1 h，4℃ 4~6 h或过夜)；
good◆gg6. 将上述混合液置于磁力架上静置1 min，然后把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测HA标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为 蛋白-磁珠复合物 ；

good◆ 洗涤
good◆gg7. 向步骤6所得的 蛋白-磁珠复合物 中加入500 µL 裂解/漂洗缓冲液 ，用移液器轻柔吹打重悬，接着在磁力架上静置1 min后，吸弃上清；
good◆gg8. 重复步骤7大约三次，直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止；
good◆gg6. 注意：如上清液的OD280仍大于0.05，则适当增加洗涤次数。

good◆ 洗脱
good◆gg9. 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
goodgoodg• 变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于变性电泳检测。向步骤8洗涤后的 蛋白-磁珠复合物 中加入80~100 µL 1×蛋白上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀，100℃加热10 min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
goodgoodg• 非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤8洗涤后的 蛋白-磁珠复合物 中加入50~100 µL 洗脱缓冲液 ，室温孵育5~10 min；将离心管在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，每100 µL洗出液中加入10 µL 中和缓冲液 将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策
go◆ 如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况?
go◆ 答：磁珠应保存在2~8℃，使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。不过，磁珠在低pH值的缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在 裂解/漂洗缓冲液 中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用 裂解/漂洗缓冲液 洗涤至中性，然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris缓冲液(pH 7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2 min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

go◆ 如何解决磁珠易粘附管壁的现象?
go◆ 答：建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。

go◆ 抗原为何没有免疫沉淀下来?
go◆ 答：① 样品中抗原含量过少，不足以被检测到
go◆ 答：① 建议：通过变性电泳或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率；如有必要，可加大样品用量；
go◆ 答：② 裂解/漂洗缓冲液 中的成分干扰了抗原与抗体的结合
go◆ 答：① 建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5% CHAPS的TBS缓冲液)。

go◆ 为何获得的蛋白量过低?
go◆ 答：① 蛋白质被降解
go◆ 答：① 建议：加入蛋白酶抑制剂；
go◆ 答：② 所用的 Anti-HA免疫磁珠 量不够
go◆ 答：① 建议：提高 Anti-HA免疫磁珠 用量；
go◆ 答：③ 样品中的目标蛋白量不够
go◆ 答：① 建议：提高抗原样品量。

go◆ 为何有多条非特异条带?
go◆ 答：有非特异性的蛋白结合在磁珠上
go◆ 答：建议：在 裂解/漂洗缓冲液 中加入50~350 mM NaCl，并加大洗脱力度和次数。

注意事项
good1. 请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠，这些操作会导致磁珠聚集而降低其结合力；
good2. 免疫(共)沉淀实验中不同类型的抗体与抗原间的亲和力是有区别的，抗体与抗原结合还会受到 裂解/漂洗缓冲液 的影响，因此，如使用本试剂盒不能获得最佳的实验结果，可自行优化操作细节或者筛选及配制合适缓冲液进行实验；
good3. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前应充分振荡混匀；
good4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good5. 本产品仅限科研使用。