- ￥1198
- 雅酶
- YJ203
- 2026年02月19日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 规格：
≥40次
经典Protein A免疫(共)沉淀试剂盒(磁珠法)
Classic Magnetic Protein A IP/Co-IP Kit
本产品 4℃运输；保存于 4℃，其中 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 (5×) 需 -20℃保存，保质期 12 个月，Protein A 磁珠 严禁冻结，长期存放请保证试剂管竖立向上，磁珠浸没于保存液中。
货号规格
goodYJ203 ≥40次
产品简介
good本产品能够高效完成抗原免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验，其核心成分Protein A磁珠采用新一代纳米表面生物技术，将Protein A高密度共价偶联在超顺磁性纳米微球表面，是纯化大多数免疫球蛋白的理想工具。与传统的Protein A免疫沉淀琼脂糖凝胶相比，Protein A磁珠具有更大的特异性表面区域及更多的表面抗体结合位点，非特异性结合低，并且每次免疫(共)沉淀可以节省40%的时间，使用起来简便高效。
good此外，本试剂盒中配有经过优化预制的各种缓冲液，为免疫(共)沉淀实验提供了合适的反应条件，增强了实验的稳定性，可应用于多种样品，细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等均可适用。
产品内容
| 组分名称 | 体积及数量 |
| Protein A磁珠 | 1 mL |
| 裂解/漂洗缓冲液 | 125 mL |
| 蛋白上样缓冲液(5×) | 10 mL |
| 洗脱缓冲液 | 5 mL |
| 中和缓冲液 | 1 mL |
操作步骤
good◆gg1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
good◆ 样1. 根A. 血清样品：若目标蛋白丰度较高，建议用 裂解/漂洗缓冲液 稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根B. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10 µL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20 min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根C. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 µL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5 mL离心管内，按每1.0×105个细胞20~30 µL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20 min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
good◆ 样1. 根D. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12,000×g，2 min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10 mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10 mL的比例加入 裂解/漂洗缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12,000~16,000×g，10 min)。
good◆gg2. 在离心管中，将500ul细胞裂解液样品与2-10ug抗体结合，推荐样品总蛋白量为500-1000ug；
good◆dddd注意：所加入样品中的总蛋白量推荐为 500~1,000µg。
good◆gg3. 置于翻转混合仪上孵育（常温1h，4℃ 4~6h或过夜），形成 抗原-抗体复合物；
good◆ 磁珠预处理
good◆gg4. 用移液器轻柔吹打 Protein A/G磁珠 ，使其充分混悬，取25 µL磁珠悬液置于1.5 mL 离心管中；
good◆gg5. 加入500 µL 裂解/漂洗缓冲液 ，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
good◆gg6. 重复步骤5一次；
good◆ 磁珠与抗原-抗体复合物结合
good◆gg7. 结合：将步骤3所得的 抗原-抗体复合物 加入预处理后的磁珠中，置于翻转混合仪上孵育（常温1h，4℃ 4~6h或过夜）。接着在磁力架上静置 1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清，离心管中剩余的即为 抗原-抗体-磁珠复合物；
good◆gg8. 洗涤：在上一步得到的 抗原-抗体-磁珠复合物 中加入500µL裂解/漂洗缓冲液，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤洗两次；
good◆ gg6. 注意：如后续做非变性洗脱，建议再向洗涤后的 抗原-抗体-磁珠复合物 中加入 500μL 超纯水， 轻柔重悬磁珠，在磁力架上静置 1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
good◆gg10. 洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
goodgoodgoodgo• 变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于变性电泳检测。向步骤9洗涤后的 抗原-抗体-磁珠复合物 中加入80~100 µL 1×上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀，100℃加热10 min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
goodgoodgoodgo• 非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤9洗涤后的 抗原-抗体-磁珠复合物 中加入50~100 µL 洗脱缓冲液 ，室温孵育5~10 min；将离心管在磁力架上静置1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，每100 µL洗出液中加入10 µL 中和缓冲液 将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。
常见问题及对策
go◆ 答：磁珠应保存在2~8℃，使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。不过，磁珠在低pH值的缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在 裂解/漂洗缓冲液 中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用 裂解/漂洗缓冲液 洗涤至中性，然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris缓冲液(pH 7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2 min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。
go◆ 答：磁珠在极少数情况下会出现结块现象，一般较难振荡打散，从而导致分布不均匀，这主要是因为磁珠在磁场中放置太久而牢固地结合在一起。用超声波水浴处理2 min即可打散磁珠，但要注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，因此磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。
go◆ 答：可以先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用 Protein A磁珠 捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。
go◆ 答：建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。
go◆ 答：① 样品中抗原含量过少，不足以被检测到
go◆ 答：① 建议：通过变性电泳或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率；如有必要，可加大样品用量；
go◆ 答：② 抗体无法结合抗原
go◆ 答：① 建议：改用另一种特异性抗体，尤其可以选择另一种识别不同抗原表位的抗体；
go◆ 答：③ 裂解/漂洗缓冲液 中的成分干扰了抗原与抗体的结合
go◆ 答：① 建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5% CHAPS的TBS缓冲液)。
go◆ 答：① 蛋白质被降解
go◆ 答：① 建议：加入蛋白酶抑制剂；
go◆ 答：② 所用的 Protein A磁珠 量不够
go◆ 答：① 建议：提高 Protein A磁珠 用量；
go◆ 答：③ 样品中的目标蛋白量不够
go◆ 答：① 建议：提高抗原样品量。
go◆ 答：有非特异性的蛋白结合在磁珠上
go◆ 答：建议：在 裂解/漂洗缓冲液 中加入50~350 mM NaCl，并加大洗脱力度和次数。
注意事项
good 5. 本产品仅限科研使用。
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原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗原和抗体的特异性结合以及 Protein A 或 G 特异性地结合到抗体的Fc 片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体，孵育后再加入Protein A 或 G 预处理的 Sepharose 珠，若细胞中有与蛋白M结合的蛋白 N，就可以形成这样一种复合物：“蛋白 N-蛋白M—抗蛋白 M 抗体—Protein A 或 G—Sepharose 珠”，经 SDS
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。 一、工作液配制 配制 100 ml 的 modified RIPA buffe： 1.称取 790 mg 的 Tris-Base，加到 75 ml 去离子水中，加入 900 mg 的 NaCl，搅拌
