Lentivirus慢病毒介导的siRNA活体实验用病毒液服

技术服务详细描述

Lentivirus 载体的技术特点
大大提高对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分裂的细胞等转导效率	快速获得高水平的表达
目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加	将免疫反应降到最低
能够插入大的片段(~7.5 kb)	能够应用于干细胞研究
最低的细胞毒性

本公司使用的慢病毒表达系统，它由三部分组成：

• 慢病毒表达载体
• 慢病毒包装质粒
• 可产生假病毒颗粒的细胞系

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

服务流程

对于活体 RNAi实验模型，吉玛公司可以为您生产高质量的病毒液，服务流程如下：

• 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），利用高效的设计软件，设计 siRNA序列，针对每条目的基因，我们设计3条siRNA序列，其中1条序列为阴性对照组；
• 根据设计好的 siRNA序列，设计，合成两条互补的短片段的DNA；
• 对合成好的 DNA片段进行稀释，退火，连接到线形化处理过的载体，转化，涂平板，过夜培养；
• 通过 PCR的方法筛选阳性菌落，进行测序，分析测序结果；
• 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的 siRNA病毒穿梭质粒；
• 利用构建好的质粒做转染实验， 48小时后通过实时荧光定量和Western的方法分析目的基因，筛选出一条最有效的siRNA序列；
• 筛选出的高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
• 浓缩、纯化病毒液，测定滴度；

提供高质量的病毒液给客户（对于活体实验，我们提供的病毒基本单位为 1×10⁸ ifu ，这个单位为一只小鼠一次实验的平均用量）

基于慢病毒系统的 RNAi沉默效果