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上海达为科生物科技有限公司
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流式细胞术(双标)实验
一、技术定义与原理
流式细胞术是一种通过流体聚焦技术使细胞单列通过激光束,利用散射光和荧光信号对单个细胞的物理、化学特性进行高通量分析的技术。双标流式细胞术通过同时标记两种荧光探针,实现对同一细胞中两种不同分子或状态的共表达分析,例如表面抗原与胞内蛋白、细胞周期与增殖标志物等。
二、实验目的与典型应用
- 免疫表型分析:检测细胞表面或胞内两种抗原的共表达(如CD34+/CD38-造血干/祖细胞分析)。
- 功能状态评估:结合细胞周期(DNA含量)与增殖标志物(Ki67)分析肿瘤细胞增殖活性。
- 凋亡检测:通过Annexin V(标记磷脂酰丝氨酸)与PI(标记死细胞DNA)区分早期/晚期凋亡。
- 亚群分选:在复杂样本中精准分选双重标记的稀有细胞群体(如肿瘤干细胞)。
三、实验流程与关键步骤
(一)样本制备(核心要求:单细胞悬液+高活性)
- 外周血/骨髓:
- 使用肝素或EDTA抗凝,4℃保存不超过48小时。
- 裂解红细胞:推荐ACK裂解液(避免淋巴细胞分离液导致细胞丢失)。
- 实体组织:
- 机械法剪碎后,用Ⅳ型胶原酶消化(37℃, 15-30分钟)。
- 关键点:过滤(40μm滤网)去除细胞团块,活性需>90%。
- 凋亡样本特殊处理:
- 必须收集培养上清:因凋亡细胞易贴壁脱落,弃上清会导致数据低估。
(二)荧光标记物选择与优化
| 荧光染料 | 激发波长(nm) | 发射波长(nm) | 适用场景 | 注意事项 |
|---|---|---|---|---|
| FITC | 488 | 530 | 表面抗原 | 易淬灭,需避光 |
| PE | 488 | 575 | 高表达抗原 | 亮度高,避免与PerCP联用 |
| APC | 633 | 660 | 低表达抗原 | 需红色激光器 |
| PI | 488 | 617 | DNA/死细胞 | 需透膜处理 |
选择原则:
- 亮度匹配:低表达抗原选用高亮度染料(如PE),高表达抗原选用低亮度(如FITC)。
- 光谱分离:两标记物的发射光谱重叠需<20%,可通过荧光补偿校正。
- 仪器兼容性:确认流式细胞仪的激光器配置(如488nm和633nm双激光系统)。
(三)抗体孵育与染色
- 表面标记:
- 直接法:预封闭Fc受体(如小鼠抗CD16/CD32)后,加入荧光偶联一抗(冰上避光孵育30分钟)。
- 胞内标记(如Ki67):
- 固定透膜:4%多ju甲醛固定后,0.1% Triton X-100透膜。
- 分步染色:先表面标记,后胞内染色以避免表位破坏。
- DNA双标(如细胞周期分析):
- 乙醇固定后,RNase处理+PI染色(需避光孵育30分钟)。
(四)仪器校准与数据采集
- 电压调节:使用标准微球校准光电倍增管(PMT)电压,确保信号在动态范围内。
- 补偿设置:
- 单染对照:分别用单一荧光标记样本调整补偿矩阵。
- FMO对照(Fluorescence Minus One):确定阴性阈值。
- 排除干扰信号:
- 粘连体:FSC-A vs FSC-H散点图排除双细胞团。
- 死细胞:7-AAD或DAPI染色后设门排除。
四、数据分析方法
(一)门控策略
- 初级门:FSC/SSC排除碎片和死细胞(图1A)。
- 二级门:通过单染对照确定阳性阈值(图1B)。
- 双标分析:
- 双参数散点图:X/Y轴分别为两种荧光信号,划分四个象限(双阳、单阳、双阴)。
- 阳性率计算:双阳性细胞比例 = (Q2+Q3)/(Q1+Q2+Q3+Q4) ×100%。
(二)案例解析
以脐血CD34+/CD38-细胞分析为例(图2):
- CD34+门:SSC低,CD34高表达。
- CD38-亚群:在CD34+门内进一步分析CD38信号,计算原始干细胞比例。
五、常见问题与解决方案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 荧光信号弱 | 抗体浓度不足/淬灭 | 滴定抗体,避光操作 |
| 背景噪音高 | 死细胞残留/补偿不当 | 加强活性染色,重设补偿 |
| 双阳性比例异常 | 光谱重叠未校正 | 调整补偿矩阵 |
| 细胞聚集堵塞仪器 | 悬液含有团块 | 增加过滤步骤(40μm滤网) |
| 阳性率与预期不符 | 阈值设定错误 | 使用FMO对照校准 |
六、技术优势与局限性
优势:
- 高灵敏度:可检测低至0.01%的稀有细胞亚群。
- 多功能性:兼容表面/胞内标记、功能分析(如钙流)。
- 临床价值:用于白血病免疫分型(如双表型急性白血病)。
局限性:
- 设备依赖:需特定波长激光器和滤光片配置。
- 操作复杂性:多色补偿调节难度随标记数增加而指数上升。

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