流式细胞术（双标）实验

一、技术定义与原理

流式细胞术是一种通过流体聚焦技术使细胞单列通过激光束，利用散射光和荧光信号对单个细胞的物理、化学特性进行高通量分析的技术。双标流式细胞术通过同时标记两种荧光探针，实现对同一细胞中两种不同分子或状态的共表达分析，例如表面抗原与胞内蛋白、细胞周期与增殖标志物等。

二、实验目的与典型应用

1. 免疫表型分析：检测细胞表面或胞内两种抗原的共表达（如CD34+/CD38-造血干/祖细胞分析）。
2. 功能状态评估：结合细胞周期（DNA含量）与增殖标志物（Ki67）分析肿瘤细胞增殖活性。
3. 凋亡检测：通过Annexin V（标记磷脂酰丝氨酸）与PI（标记死细胞DNA）区分早期/晚期凋亡。
4. 亚群分选：在复杂样本中精准分选双重标记的稀有细胞群体（如肿瘤干细胞）。

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三、实验流程与关键步骤

（一）样本制备（核心要求：单细胞悬液+高活性）

1. 外周血/骨髓：
   • 使用肝素或EDTA抗凝，4℃保存不超过48小时。
   • 裂解红细胞：推荐ACK裂解液（避免淋巴细胞分离液导致细胞丢失）。
2. 实体组织：
   • 机械法剪碎后，用Ⅳ型胶原酶消化（37℃, 15-30分钟）。
   • 关键点：过滤（40μm滤网）去除细胞团块，活性需>90%。
3. 凋亡样本特殊处理：
   • 必须收集培养上清：因凋亡细胞易贴壁脱落，弃上清会导致数据低估。

（二）荧光标记物选择与优化

荧光染料	激发波长（nm）	发射波长（nm）	适用场景	注意事项
FITC	488	530	表面抗原	易淬灭，需避光
PE	488	575	高表达抗原	亮度高，避免与PerCP联用
APC	633	660	低表达抗原	需红色激光器
PI	488	617	DNA/死细胞	需透膜处理

选择原则：

1. 亮度匹配：低表达抗原选用高亮度染料（如PE），高表达抗原选用低亮度（如FITC）。
2. 光谱分离：两标记物的发射光谱重叠需<20%，可通过荧光补偿校正。
3. 仪器兼容性：确认流式细胞仪的激光器配置（如488nm和633nm双激光系统）。

（三）抗体孵育与染色

1. 表面标记：
   • 直接法：预封闭Fc受体（如小鼠抗CD16/CD32）后，加入荧光偶联一抗（冰上避光孵育30分钟）。
2. 胞内标记（如Ki67）：
   • 固定透膜：4%多ju甲醛固定后，0.1% Triton X-100透膜。
   • 分步染色：先表面标记，后胞内染色以避免表位破坏。
3. DNA双标（如细胞周期分析）：
   • 乙醇固定后，RNase处理+PI染色（需避光孵育30分钟）。

（四）仪器校准与数据采集

1. 电压调节：使用标准微球校准光电倍增管（PMT）电压，确保信号在动态范围内。
2. 补偿设置：
   • 单染对照：分别用单一荧光标记样本调整补偿矩阵。
   • FMO对照（Fluorescence Minus One）：确定阴性阈值。
3. 排除干扰信号：
   • 粘连体：FSC-A vs FSC-H散点图排除双细胞团。
   • 死细胞：7-AAD或DAPI染色后设门排除。

四、数据分析方法

（一）门控策略

1. 初级门：FSC/SSC排除碎片和死细胞（图1A）。
2. 二级门：通过单染对照确定阳性阈值（图1B）。
3. 双标分析：
   • 双参数散点图：X/Y轴分别为两种荧光信号，划分四个象限（双阳、单阳、双阴）。
   • 阳性率计算：双阳性细胞比例 = (Q2+Q3)/(Q1+Q2+Q3+Q4) ×100%。

（二）案例解析

以脐血CD34+/CD38-细胞分析为例（图2）：

• CD34+门：SSC低，CD34高表达。
• CD38-亚群：在CD34+门内进一步分析CD38信号，计算原始干细胞比例。

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五、常见问题与解决方案

问题现象	可能原因	解决方案
荧光信号弱	抗体浓度不足/淬灭	滴定抗体，避光操作
背景噪音高	死细胞残留/补偿不当	加强活性染色，重设补偿
双阳性比例异常	光谱重叠未校正	调整补偿矩阵
细胞聚集堵塞仪器	悬液含有团块	增加过滤步骤（40μm滤网）
阳性率与预期不符	阈值设定错误	使用FMO对照校准

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六、技术优势与局限性

优势：

• 高灵敏度：可检测低至0.01%的稀有细胞亚群。
• 多功能性：兼容表面/胞内标记、功能分析（如钙流）。
• 临床价值：用于白血病免疫分型（如双表型急性白血病）。

局限性：

• 设备依赖：需特定波长激光器和滤光片配置。
• 操作复杂性：多色补偿调节难度随标记数增加而指数上升。