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- 2025年07月10日
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59
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详见说明书
- 保质期：
详见说明书
- 供应商：
上海研生
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低温冷藏
- 规格：
96T
英文名称：
产品规格：96T
发货周期：1～3天
我司细胞自噬指示探针是构建成功的含有人LC3B基因以及融合于LC3B5'-端的绿色荧光蛋白GFP基因的哺乳动物表达载体。可以通过博来霉素对细菌或哺乳动物细胞株进行细胞自噬指示探针的筛选。
GFP-LC3融合蛋白的表达使细胞自噬过程可以在活细胞内得到实时检测。在自噬体的形成过程中，GFP-LC3基因翻译并表达出带绿色荧光的LC3蛋白，LC3蛋白继而被募集至自噬体膜上，配合高分辨率显微镜，可以看到自噬过程中细胞内多处含有胞质的绿色凹陷自噬体的动态形成过程。
细胞自噬指示探针可以广泛用于多种细胞系的稳定转染。
阳性对照是含有单独GFP基因的pSELECT-NGEP-zeo质粒。
实验报告：
一、分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
培养操作步骤：1．自噬标志物LC3β(微管关联蛋白)表达载体说明书用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
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注意事项：
尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
需自备PBS。
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文献和实验人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2（Rock-2）酶联免疫分析（ELISA）
人Rho 关联含卷曲螺旋蛋白激酶2 （Rock-2 ） 酶联免疫分析（ ELISA ） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中Rho 关联含卷曲螺旋蛋白激酶2 （Rock-2 ）的 含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 人 Rho 关联含卷曲螺旋蛋白激酶 2 （ Rock-2 ） 水平。用纯化的 人 Rho 关联含卷曲
magic10号 今天刚买了merck公司的Tubulin Polymerization Inhibitor II 但是里边没有使用说明书 在网上也没有查到 希望哪位高手可以给我相关信息 也可以提供用过这种试剂的文献 感激不尽！！ freecell 你要什么样的说明书？ 它的产品说明里有篇参考文献，可参考之。 magic10号 谢谢
内某些蛋白相互作用而致表达失败。 7。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化? 8。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。 9。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度 等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。 10。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。 这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。 YONG
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