线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒

碧云天的线粒体通透性转换孔检测试剂盒(Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit or MPTP Assay Kit)是一种采用膜通透性的荧光探针Calcein AM检测线粒体通透性转换孔开放程度的试剂盒，也常用于研究细胞凋亡、坏死等细胞死亡。本试剂盒比基于线粒体膜电位的方法能更直接地检测到线粒体通透性转换孔开放程度的变化。
线粒体(mitochondrial)是细胞的能量中心，同时在细胞凋亡和坏死性细胞死亡过程中有着非常重要的作用。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP或mPTP)，又称线粒体巨型通道(mitochondrial megachannel, MMC)，是一种由线粒体膜内膜和外膜组成的非特异性的通道，在细胞死亡过程中参与线粒体内物质的释放。线粒体通透性转换孔的开放是引起细胞死亡的关键事件，在细胞的生存和凋亡的调控过程中扮演着重要角色，同时线粒体通透性转换孔在心肌缺血、再灌注损伤、创伤性脑损伤、中风等心血管疾病及肿瘤、衰老、神经变性等多个方面都有重要作用。
在健康的细胞中，线粒体内膜可维持正常的线粒体膜电位梯度以保证细胞呼吸及能量供应。随着Ca²⁺被线粒体摄入和释放，其通透性转换孔在张开和闭合状态中来回切换。但在细胞凋亡或死亡的过程中，线粒体通透性转换孔的开放显著改变了线粒体的通透性。持续的线粒体通透性转换孔开放，导致Ca²⁺过载、线粒体氧化型谷胱甘肽、线粒体中活性氧水平升高，最终导致细胞色素C的释放及线粒体膜电位降低和消失。同时，线粒体通透性转换孔具有感受器的功能，如Ca²⁺的过载、细胞色素C的释放及膜电位的消失等也会诱导该孔的持续激活。
线粒体通透性转换孔检测试剂盒的检测原理如下。试剂盒使用荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯(calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM)染色细胞。Calcein AM是一种可以对活细胞进行荧光染色的非极性染料，可通过被动运输进入细胞内并在细胞质组分包括线粒体等中积累。在细胞中，几乎没有荧光的Calcein AM被细胞内的酯酶水解去除乙酰甲酯，生成没有膜通透性的极性荧光染料钙黄绿素(Calcein or Fluorexon)，从而使Calcein滞留在细胞内，并使细胞质包括线粒体等呈现强绿色荧光。Calcein本身是一种金属络合指示剂，在生理pH条件下和Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Mn²⁺等金属离子络合时，荧光信号会发生淬灭。本试剂盒提供了CoCl₂用于淬灭细胞质中Calcein的绿色荧光，但由于正常情况下线粒体的MPTP是关闭的，此时CoCl₂不能进入线粒体，所以Calcein AM染色后经CoCl₂处理会导致仅线粒体内呈现Calcein的绿色荧光。作为对照，可将细胞用Calcein AM染色并经过CoCl₂处理之后，用钙离子载体Ionomycin进一步处理以诱导细胞外的Ca²⁺大量进入细胞内和线粒体基质并导致MPTP的开放，或者用适当的条件刺激细胞导致MPTP少量或大量开放，从而使部分Calcein释放进入细胞浆和钴离子结合而失去荧光，同时细胞浆中的钴离子能进入线粒体内而导致其中的Calcein的绿色荧光部分甚至全部淬灭，最终导致线粒体中Calcein绿色荧光减弱或消失。这样就可以根据线粒体中Calcein绿色荧光的强弱来判断线粒体MPTP开放的程度，绿色荧光越强，开放程度越低，绿色荧光越弱开放程度越高。本试剂盒的原理参考图1。

图1. 线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒原理图。Calcein AM进入活细胞后被酯酶(Esterase)催化生成Calcein，整个细胞都呈现很强的绿色荧光；氯 化 钴(含Co²⁺)处理后呈现绿色荧光的Calcein结合钴离子生成没有荧光的Calcein-2Co，但正常情况下MPTP没有打开从而钴离子不能进入线粒体，因此此时仅线粒体中呈现绿色荧光；进一步用Ionomycin处理后，使钙离子进入细胞内，导致MPTP打开，使部分Calcein从线粒体内释放，同时钴离子进入线粒体内从而使线粒体内呈现绿色荧光的Calcein也生成了没有荧光的Calcein-2Co。如果有样品可以诱导MPTP的部分或全部打开，就会导致线粒体中的绿色荧光减弱甚至消失。

Calcein AM水解产物Calcein的最大激发光波长为494nm，最大发射光波长为517nm。Calcein的激发光谱和发射光谱参考图2。

图2. Calcein的激发光谱和发射光谱。

本试剂盒内提供了1000X的Calcein AM，为了得到满意的结果，对于不同的细胞类型请自行进行一定摸索，Calcein AM的终浓度一般为0.1X-5X，最 优先的推荐终浓度为1X。使用本试剂盒检测线粒体通透性转换孔开放的效果参考图3。

图3. 使用线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒检测MPTP开放的效果图。Calcein AM (1X)与L-929细胞进行孵育，细胞质包括线粒体发出强绿色荧光(A)；细胞进一步与CoCl₂ (1X)孵育以后，细胞质内Calcein的绿色荧光被CoCl₂淬灭，仅留下线粒体内的绿色荧光(B)；使用Ionomycin (1X)处理细胞，诱导细胞外的Ca²⁺大量进入细胞内，过多的Ca²⁺进入线粒体基质，导致MPTP的开放，使部分Calcein从线粒体内释放，同时使钴离子进入线粒体内并导致Calcein的绿色荧光淬灭(C)；使用解耦联剂CCCP和FCCP (5μM)处理细胞，虽然线粒体膜电位丢失，但短时间内不会直接引起MPTP的开放，因此线粒体内绿色荧光强度无明显变化(D、E)。

由于Calcein AM的毒性特别低，并且不会抑制细胞的增殖、趋化性等绝大部分功能，所以与其它同类产品如CFDA SE等相比是更适合染活细胞的荧光探针。
本试剂盒小包装C2009S，如果用于流式细胞仪，每个样品的检测体系体积为1ml时，可以进行100次检测；96孔板每孔检测体系的体积为100μl时可以检测1000次。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存，一年有效。Calcein AM (1000X)和Ionomycin (200X)需要避光保存。
注意事项：
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
Calcein AM (1000X)须尽量避免反复冻融。如果多次使用，请注意适当分装。
CoCl₂有腐蚀性，对人体有害或有刺激性，对人体有呼吸道、生殖等特定器官毒性，或致畸致癌毒性，操作时请小心，并确保有效防护以避免直接接触人体或吸入体内，并须注意避免腐蚀其它物品。
CoCl₂对水生生物有毒或有害，禁止直接排入环境。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。