无内毒素质粒中量提取试剂盒(40～60mL)

本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5mL小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达5μg/μl。超螺旋比例可高达95%，无内毒素，转染效果好。

试剂盒特点：

• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便、从50～70mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取100～250μg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80～90%。


• 获得的质粒产量高，浓度高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。


• 内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。

试剂盒组成：

组分	20次	40次	保存
RNaseA（10mg/ml）	0.75mL	1.3mL	-20℃
溶液P1	65mL	130mL	4℃
溶液P2	50mL	100mL	室温
溶液PⅢ	50mL	110mL	室温
杂质清除剂A	1.5mL	3mL	室温
杂质清除剂B	15mL	30mL	室温
内毒素清除剂	5mL	10mL	-20℃

保存：室温储存12个月不影响使用效果。

保存事项：

• 第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。


• 内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在-20℃!


• 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。


• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项：

• 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。


• 提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对DNA的损坏。


• DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失，可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。


• 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。


• 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确切大小。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2～8℃保存。
 

• 取过夜培养菌40～60mL（最大不超过90mL）菌液，装入50mL离心管中，4500～6000×g于4℃离心5min沉淀菌体（也可12000×g离心2分钟），完全弃除上清。


• 加入2.5mL溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。室温放置3～5min。
  如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。


• 加入2.5mL溶液P2，轻轻颠倒离心管6～8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明。
  温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。


• 加2.5mL溶液PⅢ，立即颠倒离心管6～8次，充分混匀，至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12000～16000×g离心10～15min，小心吸出上清，移入新的50mL离心管中。
  加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
  注意：使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。


• 加入5mL异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。


• 于4℃ 12000～16000×g离心10min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体，加入3～5mL 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。
  DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。
  注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。


• 加入0.7mL溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。然后将质粒溶液转入1个新的1.5mL离心管中。
  可选步骤（一般不需要）：如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15min消化RNA。


• 加入55μL杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μL)冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转7～10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置≥5分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。
  内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。
  注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μL杂质清除液A，充分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。


• 42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。


• 室温14000×g离心5min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上）。
  上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
  溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。


• 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μL），轻柔混匀，4℃ 14000×g离心10min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1mL 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5～10min使乙醇完全挥发。


• 加适量TE或者纯水（50～100μL）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以辅助溶解）。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。
  最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA（高达5～10μg/μl）。如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。