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- 百奥莱博
- MT0056-HAR
- 北京
- 2025年07月12日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
95
- 英文名：
ssDNA/RNA CircLigase
- 保质期：
3年
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
2000U|20000U
特别提示：包括单链DNA/RNA环化连接酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：单链DNA/RNA环化连接酶
英文名称：ssDNA/RNA CircLigase
产品货号：MT0056
产品规格：2000U|20000U
本制品为热稳定的单链DNA/RNA连接酶，不依赖于ATP，可催化单链DNA或单链RNA的环化，也可催化其分子间连接，但其对单链DNA的连接效率更高。环化反应中，要求催化底物单链DNA/RNA具有5’-磷酸基团和3’-OH基团。对于大于15nt的单链底物，该酶都能高效的连接。该酶还可催化DNA或RNA分子与预腺苷化的DNA接头之间的连接，另外，在ATP过量的情况下，该酶可使DNA/RNA分子腺苷化。
产品组成：
| 组分 | 2000U |
| ssDNA/RNA CircLigase(100U/μl) | 20μl |
| 10×CircLigase Buffer | 250μl |
| 50mM MnCl2 | 100μl |
储存条件：-20℃可保存3年。
活性定义：60℃ 1h条件下，催化1pmol 5’-磷酸化参照Oligo（55mer)完全环化所需的酶量定义为1U。
注意事项：
1．1×CircLigase Buffer: 30mM Tris-acetate（pH 7.5), 60mM potassium acetate, 1mM DTT。
2．添加终浓度50μM的ATP可提高环化效率，高于1mM ATP浓度会抑制连接反应。
3．对于单链DNA产物的连接，需要加入终浓度2.5mM MnCl2。
4．5’端未磷酸化的底物不能用于连接，3’端无-OH的底物不能用于连接。
5．对于含有二级或复杂结构的连接底物，可加入0.4～0.8 M Betain以提高连接效率。
6．该酶对底物碱基具有选择性，5"末端连接效率: G>A>T(U)>C，3"末端连接效率T(U)>A>G，当3"端的碱基为C时不能用于连接，几乎无连接产物。
应用实例：
应用ssDNA/RNA环化连接酶环化52nt的单链DNA分子后PAGE凝胶电泳，泳道1为未加环化酶，2为加入环化酶，3为环化产物加入ExoI酶消化产物。
使用方法：
1．按以下组分配制反应液
CircLigase（100U/μl)——————————1μl
ssDNA/RNA————————————————10pmol
10×CircLigase Buffer——————————2μl
50 mM MnCl2———————————————1μl
ddH2O——————————————————Up to 20μl
60℃孵育1h进行环化反应，80℃ 10分钟失活该酶。
2．PAGE 胶检测
反应产物于20%丙xī酰胺/8M尿素变性凝胶电泳后，选择合适方法染色，观察环化或连接产物情况。未环化的底物或腺苷化的底物可用Exonuclease I酶进行消化。
使用注意事项：
1．ssRNA的连接不需要加入MnCl2。
2. 实验来看，加入20μM终浓度的ATP可提高连接效率约25%。
3. 加入0.4～0.8M Betain可提高含有二级结构的单链核酸连接效率。
4. 连接底物必须是磷酸化或腺苷化产物。
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文献和实验transcription，RT）与 PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10 个拷贝的 RNA 模板。 RNA 扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成 RNA 的互补 cDNA；加热后 cDNA 与 RNA 链解离，然后与另一引物退火，并由 DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链靶 DNA， 最后扩增靶 DNA。 cDNA 第二链的合成方法有以下几种: 1、自身引导法： 合成的单链 cDNA 3' 端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应
退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA。cDNA第二链的合成方法有以下几种: 1、自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排
因子ATP形成酶-AMP复合物。(2) 酶-AMP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化。(3) 产生一个新的磷酸二酯键,把缺口封起来.但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶是一单链多肽,分子量为68,000道尔顿,它能催化双链DNA上相邻的3-羟基和5-磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端(Cohesive ends),在T4 DNA 连接酶作用下,可连接成原来
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