5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶

5´ App DNA/RNA 热稳定连接酶可将 5´ 预腺苷化且 3´-封闭的 DNA 接头连接到 RNA 和单链 DNA 的 3´-OH。

• 分离自重组来源
• 随附 10X 反应缓冲液
• 经检测不含 DNase 和 RNase

5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶是通过对来自嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）（1）的 RNA 连接酶催化位点上的赖氨酸进行点突变得到的酶。该酶发挥作用不依赖 ATP，但需要 5´ 预腺苷化的接头连接到 RNA 或单链 DNA 的 3´-OH 末端。该酶也可催化 3´ 端发生 2´-O-甲基化的 RNA 和 5´ 腺苷化接头（1）的连接反应。连接反应的最佳温度范围为 60 - 65℃（2）。突变体连接酶无法使 RNA 或单链 DNA 的 5´-磷酸发生腺苷化，因此能减少不需要的连接产物（串联和环化）的形成。

该连接酶可在 65℃ 条件下反应，能减少 RNA 连接实验中 RNA 二级结构的限制。

产品来源

5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶是一种 His 标签融合蛋白，在大肠杆菌中表达得到。

本产品提供以下试剂或组分：

• 特性和用法

  反应条件

  1X NEBuffer™ 1
  Incubate at 65°C

  1X NEBuffer™ 1
  10 mM Bis-Tris-Propane-HCl
  10 mM MgCl₂
  1 mM DTT
  (pH 7 @ 25°C)

  贮存溶液

  50 mM KCl
  10 mM Tris-HCl
  0.1 mM EDTA
  1 mM DTT
  50% Glycerol
  pH 7.5 @ 25°C

  热失活

  否

• 优势和特性

  应用特性

  • 将 5´ 预腺苷化且 3´-封闭的 DNA 接头连接到 RNA 和单链 DNA 的 3´-OH。

• 注意事项

  1. 为了在单链 DNA 与腺苷化的 DNA 接头之间实现最佳连接，推荐使用添加了锰的 NEBuffer 1。若要将单链 RNA 与腺苷化的 DNA 接头连接，使用 NEBuffer 1 即可。
  2. DNA 与 AppDNA 的连接效率会降低，因此我们建议延长温育时间至过夜。
  3. 我们建议使用热循环仪或顶部加热来减少蒸发。
  4. 为了对酶进行灭活，我们推荐使用蛋白酶 K 处理或在 90℃ 下加热灭活 3 分钟
  5. 推荐使用蛋白酶 K 处理来释放与连接酶结合的 RNA；否则凝胶上可能出现弥散现象。

• 参考文献

  1. Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. (2012). BMC Mol. Biol.. 13, 24.
  2. Torchia, C., Takagi, Y. and Ho, C. K. (2008). Nucleic Acids Res.. 36, 6218-6227.