超高保真PCR反应预混液

特别提示：包括超高保真PCR反应预混液在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：超高保真PCR反应预混液
英文名称：HiFi PCR PreMix
产品货号：WH0173
产品规格：1ml|5ml

本制品是一种新型高保真PCR扩增预混液，适用于高通量测序文库的PCR扩增和其他PCR相关的克隆和检测。

扩增预混液中的Ultra HiFi DNA Polymerase是通过定向分子进化技术开发得到的新型快速高保真DNA聚合酶，增强了DNA聚合酶对模板的亲和力，使得此酶在扩增速度和延伸能力上得到了提升，增加了PCR成功率和产物量。同时，此酶具有优良的3"- 5"外切酶活性（Proofreading活性），保真性可达市场上主流产品水平，保证了基因和文库扩增过程中的真实性。此外，本产品中的DNA聚合酶具有热启动（Hot Start）功能，可有效的控制低温情况下的非特异扩增和酶活损耗，进而保证了PCR扩增的特异性和稳定性。

本产品为一管式预混Mix形式，内含热启动型的Ultra HiFi DNA Polymerase、超纯dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等PCR反应所需组分，只需加入模板和引物即可进行PCR扩增反应，操作简便。除此之外，预混Mix中还整合了PCR反应增强系统，不但提高了预混Mix的稳定性，使得聚合酶对PCR反应抑制剂的耐受能力增强，还提高了Ultra HiFi DNA Polymerase对不同GC含量模板的适应能力，使得本产品具有广泛的样品普适性和模板投入范围，将PCR反应的偏好性降至zuì低。

本产品的PCR产物为平末端，可加A处理再与T载体连接或直接使用平末端克隆载体进行基因克隆，如我公司的零背景快速连接试剂盒（目录号：WH0191）。

产品特点：
·扩增快速：延伸速度可达10-15 sec/kb；延伸力强：可扩增长至15 kb的DNA片段；
·特异性好：具有热启动功能，可用于多重PCR；
·灵敏度高：模板用量可低至10pg；
·偏好性低：针对不同GC含量的模板都有均衡的扩增效果；
·应用广泛：可用于高通量测序文库的PCR扩增和其他PCR相关的克隆和检测。

适用范围：
用于DNA的高保真快速扩增，如基因表达克隆、基因定点突变、基因组点突变的分析（SNP）等；更可用于高通量测序中，如高保真基因组DNA文库的富集。

产品组成：

组分	WH0173-1	WH0173-2	WH0173-3	WH0173-4
HiFi PCR PreMix	1ml	5×1ml	1ml	5×1ml
Nuclease-Free ddH2O	1ml	5×1ml	1ml	5×1ml
Loading dye in Mix	Yes	Yes	No	No

保存条件：-25~-15℃保存，避免反复冻融。保质期为一年。

操作步骤：

一、高通量测序文库的PCR扩增
  注：进行文库扩增实验时，请选用不带Loading dye（WH0173-3或WH0173-4）
1．将2×HiFi PCR PreMix、P5/P7 Primers（客户自备）和ddH2O于室温条件下（15-25°C）融化，混匀，简短离心后于冰盒上备用。
2．按照下表体系进行PCR反应体系的配制（50μl体系）：

成分	使用量	反应浓度
2×HiFi PCR PreMix	25μl	1×
P5 Primer （10μM)	5 μl	1μM
P7 Primer （10μM)	5 μl	1μM
纯化过的接头连接产物	Variable	＜1μg
Nuclease-Free ddH2O	至50 μl	-

  注：配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
3．按下表设置PCR仪反应程序，开启热盖，温度设置于105℃。

步骤	温度	时间	循环数
1	98℃	2min	1
2	98℃	20sec	6-12*
3	60℃	30sec
4	72℃	30sec
5	72℃	1min	1
6	4℃	Hold	1

  注：请根据DNA的质量和上样量确定PCR循环数。一般而言，对于100ng、10 ng、1 ng文库起始DNA，在进行PCR富集时分别需要扩增6、10、12个循环。如果在PCR富集之前经过片段大小筛选步骤（size-selection），则建议在原有基础上再增加2-4个循环；如果DNA质量较差（比如提取于FFPE样品），则建议在原有基础上再增加1-3个循环。
4．PCR样品温度降至4℃后，可将PCR产物取出并纯化回收。纯化过程可参考BaiSeq NGS文库富集试剂（目录号：WH0210)相关步骤。
5．上机测序前可使用凝胶电泳、qPCR定量或者Agilent生物分析仪对DNA文库质量进行鉴定。纯化后得到的DNA文库可保存于-20℃。

二、常规PCR扩增

（一）PCR反应液的配制：
1．将2×HiFi PCR PreMix、引物、模板和ddH2O于室温条件下（15-25°C）融化，混匀，简短离心后于冰盒上备用。
2．按照下表体系进行PCR反应体系的配制：（50μl反应体系）

成分	使用量	反应浓度
DNA Template	Variable	-
Primer F* （10μM)	1.25μl	0.25 μM
Primer R* （10μM)	1.25μl	0.25 μM
2×HiFi PCR PreMix	25μl	1×
Nuclease-Free ddH2O	To 50 μl	-

  注意1：配制反应体系时，请全程将反应管置于冰上进行操作。对于多个样品，请计算所需试剂的总体积并在此基础上额外添加10%，以避免分装过程中枪头挂壁损失而导致试剂体积不足。
  注意2：引物终浓度为0.25 μM时可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；适当减少PCR反应体系中的引物浓度则可以增加PCR反应特异性。如有必要，可以在0.2-1.0 μM间进行优化选择。
  注意3：模板DNA用量请参照如下表（50 μl PCR反应体系）

模板类型	模板用量范围	推荐模板用量
基因组DNA	1-1000ng	100-500ng
质粒DNA	0.01-100ng	1-10ng
cDNA	1-200ng	50-100ng
λDNA	0.01-100ng	1-10ng

3．按步骤2中建议模板及引物用量加入模板、引物和ddH2O，混匀后上机进行PCR反应。

（二）PCR反应条件：
1．使用2×HiFi PCR PreMix进行扩增反应时，请先使用三步法。
  注：进行三步法扩增时，按延伸速度按照10-15 sec/kb进行设定。对于DNA长度≥10 kb的模板或复杂模板，可将延伸时间延长至30 sec/kb。下述反应程序仅供参考，实际情况下，客户可按照自身情况进行更改和调整。
  三步法反应程序参考如下：

步骤	温度	时间	循环数
1	94℃	2min	1
2	98℃	10sec	35
3	60℃*	30sec
4	68℃	10-15sec/kb
5	68℃	5min	1
6	4℃	Hold	1

  注意：退火温度为60℃可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。PCR反应特异性不高时，可以在55-68℃范围内适当增加退火温度；如果引物Tm值小于63℃，可以将退火温度按Tm值进行设定。
2．当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试两步法或降落PCR（Step down PCR）。
  两步法反应程序参考如下：

步骤	温度	时间	循环数
1	94℃	2min	1
2	98℃	10sec	35
3	68℃	10-15sec/kb
4	68℃	5min	1
5	4℃	Hold	1

3．结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。注：使用WH0173-1/WH0173-2时，PCR产物可直接进行电泳检测；使用WH0173-3/WH0173-4时，请加入Loading dye（客户自备）至1×，混匀后进行电泳检测。

（三）扩增模板类型及长片段扩增举例：
1．有记录的样品适用范围和扩增长度如下表所示：

模板类型	有记录的长片段扩增
人基因组DNA	-8kb
大鼠基因组DNA	-8kb
水稻基因组DNA	-8kb
麦基因组DNA	-8kb
玉米基因组DNA	-8kb
大肠杆菌基因组DNA	-8kb
cDNA	-6kb
λDNA	-15kb

2．具体扩增效果举例：


常见问题分析：
1．无扩增产物或扩增产物很少

可能原因	解决办法
循环条件不合适	将延伸时间延长至15-30sec/kb
	增加2-5个循环
	使用Step down PCR（针对8kb 以上扩增片段效果明显）
模板DNA在质量或 数量上不满足要求	增加模板加入量
	减少模板加入量（降低过量模板的 抑制作用或者降低不纯 净模板中PCR抑制物的干扰)
	尽量用经过纯化的模板
	模板中RNA要去除干净
引物问题	引物浓度不适合，当扩增片段较长时尽 量选择相对较低的引物浓度（0.2-0.3μM)； 当模板浓度较低时，尽量选择相对较高的 引物浓度（0.3-0.5 μM）
	尽量使用新配制的引物
	引物设计不合理，重新优化引物

2．出现杂带或弥散

可能原因	解决办法
循环条件不合适	提升退火温度或尝试两步法
	使用Step down PCR
	减少2-5个循环
引物降解或设计不合理	重新配制或设计引物（适当的增加引物长 度可提高引物和模板间的特异性）
模板过量	按照说明书中推荐模板用量添加

除了超高保真PCR反应预混液,，我公司还供应以下相关产品：



名称：PCR级甲酰胺
货号：BTN100839
规格：250mg
本产品为PCR级的甲酰胺，其可以促进某些引物、模板退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度，是一种常用的PCR增强剂。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

名称：Oligo dT12-18引物(0.5μg/μL)
货号：BTN100814
规格：5μg
Oligo(dT)12-18为长度在12到18之间的Oligo(dT)混合物，可以用于以带polyA尾巴的RNA为模板的第一链cDNA合成。建议每20μL反应体系使用0.5μg oligo(dT)。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

名称：PCR Master Mix (含蓝色电泳染料)
货号：YT382
规格：400次|2000次|10000次
本品是含有蓝色染料(电泳位置约300-500bp)的2倍浓度的PCR预混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer，只需加入模板DNA、引物和水即可进行PCR扩增，并且扩增完毕后可以直接上样电泳。主要适用于cDNA或基因组DNA等的常规PCR扩增，特别适合于定性或半定量的PCR扩增，也可用于长度小于2kb的DNA片段的扩增和克隆。

本品中已经含有所有的通用组分，用户只需自备引物、模板DNA和水即可进行PCR扩增。大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。可以扩增出长达8kb的片段，但通常更适合用于扩增2kb以下的DNA片段。

本产品中加入了蓝色的电泳示踪染料，其在浓度为1%琼脂糖胶中的迁移位置大约位于300bp和500bp之间。PCR结束后可直接进行电泳检测，无需再添加上样缓冲液。蓝色示踪染料不会影响对相应DNA条带的观察和检测。

本产品稳定性高，经测试，反复冻融15次后对PCR的扩增效果无显著影响。反复冻融15次前后，使用不同引物扩增100-1500bp间不同长度目的片段的效果如下图所示。


本产品反复冻融15次前后扩增不同长度产物的效果图。A. 反复冻融前本产品进行PCR的扩增结果。B.反复冻融15次后的本产品进行PCR的扩增结果。除本产品是否反复冻融15次外，A和B的反应体系完全相同，电泳的上样量也相同。

储存条件：-20℃，有效期一年。

名称：血液直接PCR扩增试剂盒
货号：WE0120
规格：50μl×40次|50μl×200次
  本试剂盒是由热启动酶、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+以及PCR稳定剂和增强剂等组成的预混体系，本产品使用简便，无需事先提纯可直接用血液为模板扩增目的基因，可有效扩增高GC含量的模板和引物。

试剂盒组成：

组份	50μl×40次	50μl×200次
2×Blood Direct PCR Mix	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意事项：建议使用时添加≤10%的全血为模板，加上血液后用涡旋器将管中各组分轻轻混匀。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	20μl反应体系
2×Blood Direct PCR Mix	25μl	10μl
Forward Primer，10μM	1μl	0.4μl
Reverse Primer，10μM	1μl	0.4μl
Template Blood	0.5-5μl	0.25-2μl
ddH2O	up to 50μl	up to 20μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	35-40个循环
退火	55-60℃	30 s
延伸	72℃	30-60 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定，本产品中所含热启动酶的扩增效率为1-2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。