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- 外泌体（Exosome）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
- 上海
- 2026年04月29日
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- 提供商：
上海研匠生物科技有限公司
- 服务名称：
外泌体RT-PCR实验
- 规格：
/样本
1. 做外泌体RT-PCR背景和意义：
外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡(30～150 nm),它可将源自亲代细胞的特定物质递送至疾病发展相关的受体细胞,因此一直被认为可作为疾病进展的潜在生物标志物用于诊断,但具体机制仍不清楚。
外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行
CircLPAR1 是外泌体中的环状 RNA 分子,在结直肠癌(CRC)患者血浆外泌体中会发生显著变化。南京医科大学团队在 Molecular cancer 发文[1],通过对 CRC 特异性的外泌体 circRNA 进行鉴定和富集,最后使用 qPCR 检测后进行功能评估。本研究对血浆外泌体 circLPAR1 可作为 CRC 高灵敏早期诊断标志物提供了新的证据。
qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈?
我们也许会有疑问:外泌体本来就少,提取的 RNA 就更少,后续做 qPCR 检测岂不是难上加难?想知道 qPCR 检测外泌体是否具有合理性,我们需要先了解如何进行这项实验。
2. 实验过程:
(1)外泌体提取
包括研匠在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒，但是我们优先推荐超高速离心外泌体，这个是外泌体提取的金标准。样本预处理阶段很重要,甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。
(2)RNA 提取
外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。
具体操作:取 200 μl 外泌体于 1.5 ml EP 管中,加入 800 μl Trizol 试剂,充分混合,裂解 10 min,12000 rpm 离心 10 min 取上清。
(3)反转录
采用 全式金预混型快速逆转录试剂盒:适用于长片段 RNA(如 mRNA、LncRNA 等)、miRNA 加尾法逆转录试剂盒做反转录:适用于短片段 RNA(主要为 miRNA)的加尾法。
(4)qPCR 检测
采用 全式金 2×SYBR Green qPCR 试剂，适用于 ABI 7500 等设备。
(5)数据分析:采用仪器自带的 QPCR 分析软件进行数据分析
可以看到 qPCR 检测外泌体可行且可靠,但实验过程并不简单,因此我们对经常会遇到的问题及解答也进行了整理,帮助大家更好的完成实验。
qPCR检测外泌常见问题及解决方法
1. 外泌体 RNA 如何提取?
外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。
2. 外泌体 RNA 如何定量?
外泌体 RNA 含量很低,不建议使用微量紫外分光光度计定量,可以使用 Agilent 2100 生物分析仪等定量,也可以直接按最大体积进行逆转录实验。
3. 外泌体做 qPCR 检测应该选什么参照?
外泌体没有通用的内参选择,可以使用外参(cel-miR-39)作为参照。
4. 外泌体多样本进行 qPCR 检测时,扩增曲线和溶解曲线有差异,是否正常?
一般来说属于正常现象,由于外泌体不像细胞或者组织来源稳定,不同外泌体样本及处理的差异,可能导致外泌体里核酸含量及片段大小不同,会产生扩增曲线或溶解曲线的差异。
5. 外泌体 qPCR 检测 CT 值较大是否正常?
属于正常现象,由于外泌体 RNA 含量较低,特别是一些低丰度的基因 CT 值会较大,可以选择高效的反转录及 PCR 试剂。
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文献和实验[2] kach M, et al. Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go. Cell. 2016 Mar 10;164(6):1226-32
[3] Zhou W, Fong M Y, Min Y, et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer cell. 2014, 25(4): 501-515.
[4]Takahashi KJ, Yan IK, Wood J, et al. Involvement of Extracellular Vesicle Long Noncoding RNA (linc-VLDLR) in Tumor Cell Responses to Chemotherapy. Mol Cancer Res.2014 ,12(10): 1377–87.
[5]Li Y, Zheng QP, Bao CY, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 2015, 25(8):981-4.
[6]Melo SA, Sugimoto H, O'Connell JT, et al. Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis. Cancer Cell, 2014.
实验目的： 通过 Aco600 染料标记外泌体，并与受体细胞共孵育，通过激光共聚焦显微镜观察外泌体被靶细胞的摄取情况。 实验材料： 外泌体红色荧光标记染料 Aco600（Umibio UR52423） Exosome 来自 MCF 细胞无血清培养基（Umibio，UR51102）条件下获得，通过超速离心方式获得。（也可直接采购 Umibio 的成品外泌体） Aco600-Exosome：24 孔板每孔外泌体总颗粒数: 1×1010 个（5×109-1×1010），外泌体体积 100-300ul
的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链； (2) Rnase 水解活性：水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA； (3)依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA. 二、RT-PCR的准备 1. 引物的设计及其原则： (1)引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。 在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在
实验目的： 通过 DIR 染料标记外泌体，通过尾静脉注射 DIR-labeled Exosome，24 小时内观察外泌体在体内的代谢情况。 实验材料： DIR- Exosome，裸鼠； DIR-Exosome：染料终浓度 1uM，外泌体 200ug，体积 200ul； Exosome 来自 HEK293 无血清培养基（Umibio，UR51102）条件下获得，通过外泌体提取试剂盒提取（Umibio，UR52121）。 实验内容： 1、通过尾静脉注射 200 ug/支的 DIR- Exosome
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