植物基因表达农杆菌双元载体

概述

基于双元载体的农杆菌介导的遗传转化是制备转基因植物的有效方法。该系统利用细菌根瘤农杆菌杆菌将外源DNA整合到多种植物细胞基因组。

农杆菌双元载体系统来源于天然肿瘤诱导（Ti）质粒，农杆菌将Ti-质粒中的转移DNA（T-DNA）区域整合到植物宿主基因组中。T-DNA位于两个25 bp的T-DNA边界重复序列之间，且两个T-DNA边界重复序列方向相同。在我们的双元载体系统中，所有与肿瘤形成相关的序列都被去除，仅留下T-DNA边界重复序列，两个T-DNA边界重复序列中间的目的序列将整合到宿主基因组中。

完整的双元载体系统由两部分组成。第一种被称为T-DNA双元载体（或简称为“双元载体”），包含两个T-DNA重复序列，用户感兴趣基因将被克隆到两个T-DNA重复序列之间。第二种载体称为vir辅助质粒，负责编码将两个T-DNA重复序列之间的区域整合到植物细胞基因组中所必需的组分。需要通过共转化、共电转或融合的方式将这两种质粒一起导入根癌土壤杆菌中，然后使用该菌株侵染宿主植株。

当双元载体和vir辅助质粒共存于农杆菌时，由vir辅助质粒编码的蛋白反式作用于T-DNA边界重复元件以介导加工，分泌和宿主基因组的整合。

亮点

我们的根癌农杆菌双元载体系统能够有效地将序列插入到靶植株基因组中。双元载体质粒经过优化后，能够在大肠杆菌和农杆菌中进行复制，可介导目的序列高效整合到靶植物细胞中，实现外源基因的高水平表达。
 

优势

外源基因的稳定整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反的是，利用农杆菌侵染植物细胞可以将载体上的T-DNA区域的目的基因永久导入到宿主植物细胞中。

技术简单：可用双元载体直接转化农杆菌或植物细胞。

载体装载量大：我们的农杆菌双元载体可以容纳长达20 kb的片段。
 

不足之处

3' 序列缺失：在植物细胞中，核苷酸降解通常会导致T-DNA左边界（3'）序列缺失。然而，由于用户的目的序列被克隆在右边界附近，从左边界开始的降解仅会影响标记基因的表达。所以，关于这一点并不需要过分担心。

匹配的农杆菌菌株和标记：在进行植物载体实验时，必须注意选择与特定双元载体和抗性标记基因高效匹配的农杆菌菌株。例如，某些农杆菌菌株本身表达抗性基因，则具有相同筛选标记的双元载体不能与该菌株匹配使用。

骨架序列的整合：在某些情况下，载体骨架序列可能会与T-DNA边界重复之间的序列一起发生整合。 
 

载体关键元件

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. This is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

Nos pA: The nopaline synthase polyadenylation signal of Agrobacterium tumefaciens. This facilitates transcription termination of the upstream ORF.

RB T-DNA repeat: Right border repeat of T-DNA. Upon recognized by Ti plasmid in Agrobacterium, the region between the T-DNA border repeats is transferred to plant cells.

pVS1 StaA: Stability protein from the plasmid pVS1. Essential for stable plasmid segregation in Agrobacterium.

pVS1 RepA: Replication protein from the plasmid pVS1. Permits replication of low-copy plasmids in Agrobacterium.

pVS1 oriV: Origin of replication from the plasmid pVS1. Permits replication of low-copy plasmids in Agrobacterium.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Facilitates plasmid replication in E. coli. Plasmids carrying this origin exist in low copy numbers (15-20 per cell) in E. coli if Rop protein is present, or medium copy numbers (100-300 per cell) if Rop protein is absent.

Kanamycin: Kanamycin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by kanamycin selection in bacterial hosts.

LB T-DNA repeat: Left border repeat of T-DNA. Upon recognized by Ti plasmid in Agrobacterium, the region between the T-DNA border repeats is transferred to plant cells.

CaMV 35S_enhanced: A strong chimeric promoter which drives marker expression.

CaMV 35S pA: Cauliflower mosaic virus 35S polyadenylation signal. This facilitates transcription termination and polyadenylation of the marker gene.

Marker: A drug selection gene, allowing selection of plant cells transduced with the vector.