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果蝇基因表达att位点整合载体
企业认证
云舟生物科技(广州)股份有限公司
提供定制载体
我们的pUASTattB载体系统是一个高效的转基因果蝇制备和基因表达控制系统。该系统利用噬菌体φC31整合酶介导的重组实现靶向基因有效插入,并结合强大的诱导型启动子Gal4调节转基因表达。pUASTattB载体系统类似于pUAST系统,然而它是利用φC31整合酶介导重组而不是基于P元件的转座实现目的基因的插入。
噬菌体φC31整合酶能高效介导噬菌体附着位点(称为attP)和细菌附着位点(称为attB)之间的序列特异性重组。与基于转座子系统(如P元件介导的重组)相反,φC31介导的插入是不可逆的。pUASTattB整合到attP位点后会产生两个新的位点(attL和attR),新的位点将不再被φC31整合酶识别。另外,基于φC31的插入是具有位点特异性的,通常仅在attP位点发生。基于这个原因,pUASTattB载体系统通常用于携带attP“着陆位点”的果蝇系。
pUASTattB系统包含两个载体,一个称为pUASTattB载体或是携带attB位点和目的基因的φC31供体载体;另一个为编码φC31整合酶的辅助载体。当pUASTattB和φC31辅助质粒共同注射到含有attP位点的细胞时,φC31整合酶介导attB和attP位点之间发生重组,导致pUASTattB载体线性化并整合到宿主基因组中。 mini white基因的表达,可以使果蝇的眼色发生变化,是鉴定转基因果蝇成功与否的标记。
将φC31整合酶引入果蝇宿主有多种方法,可以使用体外转录产生的φC31整合酶mRNA注射靶细胞,也可以将表达φC31整合酶的辅助质粒与pUASTattB载体一起共注射到细胞中。此外,也可以利用φC31整合酶果蝇系实现基因的高效插入。
在pUASTattB系统中,目的基因将被克隆到合成诱导型启动子的下游,该启动子由5个串联排列的GAL4结合位点(5xUAS)和hsp70 TATA box组成。目的基因依赖于GAL4的表达,GAL4蛋白在与pUAST质粒上的UAS位点结合后会激活目的基因的转录。因此,在没有GAL4表达的情况下,目的基因保持沉默,但是通过与表达GAL4的果蝇系杂交后,在GAL4表达的细胞中,目的基因会被转录激活。
我们的pUASTattB果蝇基因表达载体可有效实现φC31整合酶介导的基因插入或目的基因GAL4依赖性表达。我们的载体在大肠杆菌中具有高拷贝,可用于高效产生转基因果蝇。
特定位点插入:基于φC31的插入具有位点特异性,通常仅发生在attP位点,降低了破坏内源基因或插入位点不当影响转基因表达的风险。
高水平表达:5×UAS/mini_Hsp70启动子可以在诱导状态下使目的基因高水平表达。
选择性表达: 不存在GAL4的情况下,目的基因的转录水平很低或没有;在GAL4的存在下,则能实现高水平的基因转录。
高效:使用φC31整合酶实现种系转基因比基于P元件的载体系统如pUAST更有效。
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