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- 2026年05月31日
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概述
该载体系统设计用于体外哺乳动物启动子的有效分析。通常，将假定的目标启动子克隆到该载体中，并且所得构建体用于转染感兴趣的哺乳动物细胞系。然后，下游荧光或化学发光报告基因的表达可用作增强子活性的读数。
该载体系统可用于鉴定启动子元件、确定启动子的组织特异性、比较启动子变体以及许多其他应用。
该载体可以通过常规转染引入哺乳动物细胞。通过常规转染将质粒载体递送到哺乳动物细胞中是生物医学研究中使用最广泛的程序之一。虽然多年来已经开发了几种复杂的基因递送载体系统，如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac，但在许多实验室中，传统的质粒转染仍然是基因递送的主力。这主要是由于其技术简单性以及在各种细胞类型中的良好效率。使用常规质粒载体转染的一个关键特征是它是瞬时的，只有非常低比例的细胞稳定地将质粒整合到基因组中（通常小于1%）。
亮点
我们的载体基于常规质粒系统。要测试的推定启动子被放置在报告基因的上游。虽然活性启动子会驱动下游报告基因的表达，但在没有启动子活性的情况下，报告基因表达很少或没有。使用视觉上可检测的明亮荧光蛋白（如TurboGFP）或化学发光蛋白（如荧光素酶）作为报告基因，其允许在体外高度灵敏地检测启动子活性。
优势
技术简单： 通过传统转染将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单，并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
非常大的载货空间：我们的载体可以容纳~30 kb的总DNA。这允许测试大的假定启动子序列。
简单灵敏的读数： 使用视觉上可检测到的明亮荧光蛋白（如TurboGFP）或化学发光蛋白（如荧光素酶）作为报告基因，从而在体外高度灵敏地读取启动子活性。
不足之处
有限的细胞类型范围：质粒转染的效率因细胞类型而异。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染，原代细胞通常比永生化细胞系更难转染。众所周知，一些重要的细胞类型，如神经元和胰β细胞，很难转染。此外，质粒转染在很大程度上仅限于体外应用，很少在体内使用。
Promoter: Your promoter of interest is placed here.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.
Reporter: A visually detectable bright fluorescent protein gene (such as TurboGFP) or a chemiluminescent protein gene (such as luciferase). This allows highly sensitive detection of promoter activity in vitro.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
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文献和实验
| 引用 | 主题 |
|---|---|
| 计算机化学 23：191 （1999） | 真核启动子预测研究进展 |
| 生物学杂志 273：10530 （1998） | 使用lacZ报告质粒分析体内启动子活性 |
| 方法分子生物学977：79（2013） | 用于启动子分析的双荧光素酶报告系统的表征 |
重组插入目的片段，启动子，终止子等是构建完整表达框时所需要的元件，标签序列等可以用于表达鉴定等实验。在质粒载体设计及构建工作中，根据实验的需求情况可以增减质粒载体上的具体元件，以及插入实验需要的相关基因。 2、质粒载体构建的常规流程 通常质粒载体构建的操作需要经过下图所示流程。其中目标序列确定需要根据实验需求以及查阅生物信息数据库的相关序列来确定。目标序列 PCR 扩增则根据实验需求以基因组 DNA 或者反转录得到的 cDNA 为模板，经过高保真 PCR 实验扩增得到相关目的片段。质粒载体确定由实验
要有特定的启动子参与。 增强子具有以下特点：1)具有远距离效应;2)无方向性;3)顺式调节;4)无物种和基因的特异性;5)具有组织特异性;6)有相位性;7)有的增强子可以对外部信号产生反应。 沉默子 是参与基因表达负调控的一种元件。能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。 绝缘子 是真核生物基因组的调控元件之一，亦为一种边界元件。功能为阻止临近调控元件，对它所界定基因的启动子其增强或者阻遏的作用
是一种功能强大的分析工具，可用于基因或基因产物的功能和调控研究，用于生成转基因生物，并用作基因治疗方法。 基因表达 转染最常通过使用质粒载体或 mRNA 在培养细胞(或动物模型)中表达目的蛋白。利用真核细胞中的蛋白表达可以生成经过适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。另外，将带有可检测的标记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子和增强子序列或蛋白: 蛋白相互作用的研究。 此外，根据转染策略的不同，转染还可应用于各种形式的生物生产。例如，导入重编程转录因子可以生成诱导多能性干细胞（iPSC）。另一
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