哺乳动物基因编辑Cas9表达腺相关病毒

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概述

CRISPR / Cas9载体是几种新兴的基因组编辑工具之一，可以在基因组的靶位点快速有效地创建突变（另外两种流行的是ZFN和TALEN）。
 

Cas9是一类RNA引导的DNA核酸酶的成员，它们是天然原核免疫系统的一部分，可赋予对外来遗传元素（如质粒和噬菌体）的抗性。在细胞内，Cas9酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，通过与基因组中同源的18-22nt靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点的杂交定位Cas9，然后切割基因组中的靶位点。
 

为了实现CRISPR介导的基因靶向，靶细胞必须同时共表达Cas9和靶位点特异性gRNA。这可以通过表达来自同一载体（又名多合一载体）的Cas9和gRNA序列或使用单独的载体来驱动Cas9和gRNA表达（分别是仅Cas9和仅gRNA载体）来实现。与一体化载体相比，使用单独的载体表达Cas9和gRNA的优势在于，根据用户的实验目标，它可以灵活地组合使用不同的gRNA表达载体与各种Cas9变体（野生型核酸酶、切口酶、核酸酶死）。
 

我们在Cas9核酸酶系列中提供了源自化脓性链球菌的最广泛使用的SpCas9的多种变体，以方便您在我们的在线门户网站上进行载体设计。这些变体包括 - hCas9，野生型SpCas9的人源化版本，可在目标位点有效产生双链断裂（DSB）;hCas9-D10A，hCas9的“切口酶”突变形式，仅在DNA中产生单链切割;dCas9，SpCas9的催化无活性变体，携带D10A和H840A突变;SpCas9-HF1，SpCas9的高保真变体;和eSpCas9，SpCas9的增强特异性变体。dCas9与dCas9 / VP64和dCas9 / VPR等激活域或抑制结构域（如dCas9 / KRAB）的融合也分别可用于CRISPRa和CRISPRi应用。此外，我们提供源自金黄-色葡萄球菌的 SaCas9，用于需要更短 Cas9 变体的应用，而源自酸氨基球菌的 Spcas9 和 AsCpf1 可通过交错的 DNA 双支架断裂实现 DNA 切割。
 

AAV Cas9表达载体首先在大肠杆菌中构建为质粒。然后将其与辅助质粒一起转染到包装细胞中，其中两个倒置末端重复序列（ITR）之间的载体区域被包装成活病毒。放置在两个ITR之间的Cas9表达盒与病毒基因组的其余部分一起被引入靶细胞中。用户选择的启动子驱动Cas9表达，然后在存在靶位点特异性gRNA序列的情况下将其定向到感兴趣的DNA靶位点。
 

野生型AAV基因组是一种线性单链DNA（ssDNA），两端有两个ITR形成发夹结构。因此，它也被称为ssAAV。为了在宿主细胞中表达ssAAV载体上的基因，ssDNA基因组需要首先通过两条途径转化为双链DNA（dsDNA）：1）以现有的ssDNA基因组为模板，以3' ITR为启动位点，通过宿主细胞的DNA聚合酶机制合成第二链DNA;2）正负链ssAAV基因组之间分子间dsDNA的形成。前者是主导途径。
 

AAV基因组DNA在宿主细胞核中形成游离体连接体。在非分裂细胞中，这些连接体可以在宿主细胞的一生中保留。在分裂细胞中，AAV DNA通过细胞分裂的稀释效应而丢失，因为游离体DNA不会与宿主细胞DNA一起复制。AAV DNA可以随机整合到宿主基因组中，但极为罕见。这在许多基因治疗环境中是可取的，在这些环境中，载体整合的潜在致癌作用可能引起重大关注。
 

AAV的一个主要实际优势是，在大多数情况下，AAV可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理。这是由于AAV本质上缺乏复制，产生很少或没有炎症，并且没有引起已知的人类疾病。由于在宿主生物体中的免疫原性低，我们的AAV Cas9表达载体是基于CRISPR的体内应用的完美工具。
 

在自然界中已经鉴定出许多AAV菌株。它们根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原性分为不同的血清型。不同的血清型可以使病毒具有不同的组织嗜性（即感染的组织特异性）。当我们的AAV载体被包装成病毒时，通过使用不同的衣壳蛋白进行包装，可以将不同的血清型赋予病毒。我们目前为AAV载体系统提供的血清型包括 - 血清型1，2，3，4，5，6，6.2，7，8，9，rh10，DJ，DJ / 8，P-HP.eB，P-HP。S，AAV2-复古和AAV2-QuadYF。下表列出了不同的AAV血清型及其组织嗜性。