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概述
该载体系统设计用于体外有效分析哺乳动物顺式调节元件。通常,将目标的假定增强子克隆到该载体中,并将所得构建体用于转染感兴趣的哺乳动物细胞系。然后,下游荧光或化学发光报告基因的表达可用作增强子活性的读数。
该载体系统可用于识别增强子元件、确定增强子的组织和空间特异性、比较增强子变体以及许多其他应用。
该载体可以通过常规转染引入哺乳动物细胞。通过常规转染将质粒载体递送到哺乳动物细胞中是生物医学研究中使用最广泛的程序之一。虽然多年来已经开发了几种复杂的基因递送载体系统,如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac,但在许多实验室中,传统的质粒转染仍然是基因递送的主力。这主要是由于其技术简单性以及在各种细胞类型中的良好效率。使用常规质粒载体转染的一个关键特征是它是瞬时的,只有非常低比例的细胞稳定地将质粒整合到基因组中(通常小于1%)。
亮点
我们的载体基于常规质粒系统。待测的推定增强子被放置在最小启动子的上游,该启动子控制下游报告基因的表达。活性增强子会刺激最小的启动子,驱动报告基因的表达。在缺乏增强子活性的情况下,最小启动子具有非常弱的基础活性,因此产生很少或没有报告基因表达。使用视觉上可检测的明亮荧光蛋白(如TurboGFP)或化学发光蛋白(如荧光素酶)作为报告基因,这允许在体外高度灵敏地检测增强子活性。
优势
技术简单: 通过传统转染将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单,并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
非常大的载货空间: 我们的载体可以容纳~30 kb的总DNA。这允许测试大的假定增强子序列。
简单灵敏的读数:使用视觉上可检测到的明亮荧光蛋白(如TurboGFP)或化学发光蛋白(如荧光素酶)作为报告基因,从而在体外高度灵敏地读取增强子活性。
不足之处
有限的细胞类型范围: 质粒转染的效率因细胞类型而异。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞通常比永生化细胞系更难转染。众所周知,一些重要的细胞类型,如神经元和胰β细胞,很难转染。此外,质粒转染在很大程度上仅限于体外应用,很少在体内使用。
载体关键元件
Enhancer: Your enhancer of interest is placed here.
Minimal promoter: A user-selected minimal promoter sequence is placed here. This will drive transcription of the downstream reporter if an enhancer element is present to activate it. In the absence of such enhancer activity, the minimal promoter will be almost completely inactive.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.
Reporter: A visually detectable bright fluorescent protein gene (such as TurboGFP) or a chemiluminescent protein gene (such as luciferase). This allows highly sensitive detection of enhancer activity in vitro.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.