- ￥1880
- 该载体系统设计用于通过观察EGFP荧光，比较哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9 gRNA的切割效率。该常规载体技术简单，易于使用。
- 广州
- 2026年02月04日
企业认证
相关产品推荐更多 >
万千商家帮你免费找货
0 人在求购买到急需产品
- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
云舟生物科技（广州）股份有限公司
- 服务名称：
提供定制载体
概述
CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一，可以快速有效地在基因组的靶位点产生突变（另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN）。这些质粒载体编码序列特异性RNA介导的DNA核酸酶（或切口酶），可用于编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。
常规质粒gRNA特异性检测载体设计用于测试CRISPR/Cas9对一个或多个gRNA靶序列的切割效率。该系统允许用户通过比对多个gRNA靶位点来筛选出最有效的CRISPR/Cas9靶点。
常规质粒gRNA特异性检测载体系统的基础是位于强启动子EF1A下游的无活性且分隔开的EGFP ORF。将待测试的gRNA靶位点克隆在两个不完整的无功能性的EGFP ORF（称为EGFP-L和EGFP-R）之间。EGFP-L由EGFP ORF的上游468 bp组成，EGFP-R对应于EGFP ORF下游的268 bp-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 bp与EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。
当常规质粒gRNA特异性检测载体单独转染到细胞中时，不会观察到绿色荧光，因为EGFP-L和EGFP-R都不编码功能性荧光蛋白。然而，如果将该载体与Cas9和相应的gRNA载体一起共转染到细胞中，则gRNA-Cas9复合物将被募集到EGFP-L和EGFP-R之间的gRNA靶序列，从而切割产生双链DNA断裂（DSB），随后EGFP-L和EGFP-R的同源区域发生同源重组。同源重组将产生完整的功能性EGFP ORF，继而产生绿色荧光蛋白。在该系统中，可以在EGFP-L和EGFP-R之间串联克隆多个gRNA靶位点（每个都应包含PAM序列），并且可以通过与Cas9和相应的gRNA共转染分别测试。通过分析产生EGFP荧光细胞的效率，比较不同gRNA靶位点被CRISPR/Cas9切割的效率。
亮点
该载体系统设计用于通过观察EGFP荧光，比较哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9 gRNA的切割效率。该常规载体技术简单，易于使用。
优势
测试系统简单：使用该系统分析gRNA靶点切割效率简单、快速。
灵敏且稳定：即使在拷贝数非常低的细胞中，EF1A强启动子和EGFP荧光的稳定表达的特性也有助于检测到荧光信号。
技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。
不足之处
系统简化：在常规质粒gRNA特异性检测载体中，gRNA靶序列与基因组中目的基因的遗传背景不同。在进行测试时，gRNA特异性检测载体可以以高拷贝的形式存在于细胞中。在该测试系统中，CRISPR/Cas9对靶位点的切割效率可能在某种程度上会发生改变。
无法检测脱靶效应：该系统仅能检测CRISPR/Cas9对gRNA靶位点的切割效率，而无法提供关于脱靶效应的数据。
载体关键元件
EF1A promoter: Human eukaryotic translation elongation factor 1 α1 promoter. A strong, constitutive promoter driving the expression of EGFP-L:gRNA Target:EGFP-R cassette.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.
EGFP-L: Corresponds to positions 1-468 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.
gRNA Target Sequence: The gRNA target sequence to be tested is cloned here. Multiple gRNA target sequences can be cloned here in tandem. PAM sequence must be included.
EGFP-R: Corresponds to positions 268-720 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as mCherry, should avoid green fluorescent protein), or a dual-reporter gene (such as mCherry/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.
BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
风险提示：丁香通仅作为第三方平台，为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全，合理判断，谨慎选购商品，商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品，请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
文献和实验关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。
| 参考文献 | 主题 |
|---|---|
| Appl Biochem Biotechnol. 180:655 (2016) | Description of gRNA sensor system |
1、质粒的概念 质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A
Cell Rep：上海科技大学季泉江团队开发出高效微型 CRISPR-SpaCas12f1 基因编辑系统
。同时，研究人员发现 SpaCas12f1 的 tracrRNA 具有独特的 head-to-toe 的发夹结构，这是限制 SpaCas12f1 在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对 RNA 二级结构预测及小 RNA 测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导 RNA，成功地获得了高效的引导 RNA，gRNA_MS13，从而实现 CRISPR-SpaCas12f1 高效哺乳动物细胞编辑。 这项研究扩展了微型 CRISPR 核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型 CRISPR 系统提供
Cell：诺奖得主新作！在大量病毒中发现微型 CRISPR 系统，可高效编辑人类和植物基因组
，同时其准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力也为植物、动物和微生物基因组编辑提供了强大的工具。 在最新发表的 Cell 论文中，诺奖得主 Jennifer A. Doudna 的团队发现在噬菌体病毒中也编码着丰富多样的微型 CRISPR-Cas 系统。其中一些 CRISPR-Cas 系统可以用于编辑哺乳动物和植物的基因组，并具有结构紧凑和编辑效率高的特点，是极富潜力的未被开发的小型基因编辑工具。 2022 年 11 月 23 日，该研究以题为 Diverse virus
技术资料暂无技术资料 索取技术资料
