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- 能实现高效的CRISPR靶向
- 广州
- 2026年02月08日
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云舟生物科技（广州）股份有限公司
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提供定制载体
Cas9是一类RNA引导的DNA核酸酶的成员，它们是天然原核免疫系统的一部分，可赋予对外来遗传元素（如质粒和噬菌体）的抗性。在细胞内，Cas9酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，通过与基因组中同源的18-22nt靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点的杂交定位Cas9，然后切割基因组中的靶位点。
为了实现CRISPR介导的基因靶向，靶细胞必须同时共表达Cas9和靶位点特异性gRNA。这可以通过表达来自同一载体（又名多合一载体）的Cas9和gRNA序列或使用单独的载体来驱动Cas9和gRNA表达（分别是仅Cas9和仅gRNA载体）来实现。与一体化载体相比，使用单独的载体表达Cas9和gRNA的优势在于，根据用户的实验目标，它可以灵活地组合使用不同的gRNA表达载体与各种Cas9变体（野生型核酸酶、切口酶、核酸酶死）。
腺病毒gRNA表达载体是一种高效的工具，用于将腺病毒介导的靶位点特异性gRNA序列引入多种哺乳动物细胞类型中，其中载体保持为游离体DNA，而不整合到宿主基因组中。它是体内首要选的基因传递系统，常用于基因治疗和疫苗接种。首先在大肠杆菌中构建腺病毒gRNA表达载体作为质粒。在载体构建过程中，由驱动靶位点特异性gRNA序列的人U6启动子组成的gRNA表达盒在两个倒置末端重复序列（ITR）之间克隆。然后将其转染到包装细胞中，其中ITR之间的载体区域被包装成活病毒。当病毒被添加到靶细胞中时，DNA货物被传递到细胞中，在那里它进入细胞核并保持为游离体DNA，而不整合到宿主基因组中。在载体构建过程中放置在两个ITR之间的gRNA表达盒与病毒基因组的其余部分一起被引入靶细胞中。
我们的腺病毒gRNA表达载体可用于表达单gRNA或双gRNA。虽然单gRNA载体广泛用于传统的CRISPR基因组编辑，例如产生单基因敲除，但双gRNA载体对于需要同时靶向一对基因组位点的应用是必要的。此类应用的示例包括：1）配对的Cas9切口酶实验，其中hCas9的“切口酶”突变形式（hCas10-D9A）与靶向单个靶位点的两条相反链的两个gRNA结合使用，以在每条链上产生单链切割一个，从而导致DSB的靶向特异性高于单个gRNA;2）在一对gRNA靶向的两个DSB之间产生片段的缺失;3）同时靶向两个不同的基因。单个 gRNA 载体由单个人 U6 启动子组成，驱动两个 ITR 之间的靶位点特异性 gRNA 序列，而双 gRNA 载体由两个连续的 U6 启动子组成，驱动特定于两个目标基因组靶位点的 gRNA 序列的表达。
根据设计，腺病毒载体缺乏E1A，E1B和E3基因（delta E1 + delta E3）。前两个是生产活病毒所必需的（这两个基因被设计到包装细胞的基因组中）。因此，由载体产生的病毒具有复制不全的重要安全特征（这意味着它们可以转导靶细胞但不能在其中复制）。
亮点
宿主基因组破坏风险低： 转导到宿主细胞后，腺病毒载体在细胞核中保留为游离体DNA。缺乏与宿主基因组的整合可能是体内人类应用的理想特征，因为它降低了可能导致癌症的宿主基因组破坏的风险。
非常高的病毒滴度： 在我们的腺病毒载体被转染到包装细胞中以产生活病毒后，病毒可以通过重新感染包装细胞进一步扩增到非常高的滴度。这与慢病毒、MMLV 逆转录病毒或 AAV 不同，后者不能通过再感染扩增。当通过我们的病毒包装服务获得腺病毒时，滴度可以达到>1011每毫升感染单位（IFU/毫升）。
广义向性： 来自常用哺乳动物物种（如人类，小鼠和大鼠）的细胞可以用我们的载体转导，但某些细胞类型已被证明难以转导（见下面的缺点）。
体外和体内有效性： 我们的载体通常用于转导活体动物的细胞，但它也可以在体外有效使用。
安全： 我们的载体的安全性是由它缺乏病毒生产所必需的基因（这些基因被工程到包装细胞的基因组中）这一事实来保证的。因此，由我们的载体制成的病毒是复制能力不全的，除非它用于转导包装细胞。
难以转导某些细胞类型： 虽然我们的腺病毒载体可以转导许多不同的细胞类型，包括非分裂细胞，但它对某些细胞类型（如内皮细胞、平滑肌、分化气道上皮、外周血细胞、神经元和造血细胞）效率低下。
免疫原性强： 来自腺病毒载体的活病毒可以在动物中引起强烈的免疫反应，从而限制了某些体内应用。
技术复杂性： 腺病毒载体的使用需要在包装细胞中产生活病毒，然后测量病毒滴度。这些程序在技术上要求很高且耗时。
PAM 要求：基于CRISPR/Cas9的靶向依赖于对位于gRNA识别序列3'末端的原间隔相邻基序（PAM）的严格要求。所需的PAM序列因所使用的Cas9变体而异。
Single-gRNA expression adenoviral vector
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.
Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.
U6 Promoter: Drives expression of the downstream gRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
Marker: A visually detectable fluorescent gene (such as EGFP). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.
TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.
Dual-gRNA expression adenoviral vector
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.
Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.
U6 Promoter: Drives expression of the downstream gRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA #1: The first guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
gRNA #2: The second guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
Marker: A visually detectable fluorescent gene (such as EGFP). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.
TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.
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文献和实验| 引用 | 主题 |
|---|---|
| 科学。339:819 (2013) | 使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的描述 |
| 细胞。154:1380–9 (2013) | 使用 Cas9 D10A 双切口提高特异性 |
| 科学代表 4：5105 （2014） | 使用表达腺病毒gRNA的载体靶向CRISPR/Cas9 |
| 普洛斯一号。12： e0187236 （2017） | 用于双 gRNA 表达的 CRISPR/Cas9 载体 |
Cell Rep：上海科技大学季泉江团队开发出高效微型 CRISPR-SpaCas12f1 基因编辑系统
。同时，研究人员发现 SpaCas12f1 的 tracrRNA 具有独特的 head-to-toe 的发夹结构，这是限制 SpaCas12f1 在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对 RNA 二级结构预测及小 RNA 测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导 RNA，成功地获得了高效的引导 RNA，gRNA_MS13，从而实现 CRISPR-SpaCas12f1 高效哺乳动物细胞编辑。 这项研究扩展了微型 CRISPR 核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型 CRISPR 系统提供
Nat Methods：陈玲玲/杨力/李劲松等开发新技术，实现环状 RNA 功能性筛选和研究
Methods 官网）前述实验结果表明 RfxCas13d 是一种高效、特异的 circRNA 敲除工具。研究团队构建了靶向 9 个人类细胞系中 2908 个高表达 circRNA 的 BSJ-gRNAs 文库，尝试使用该工具鉴定潜在的参与细胞增殖的候选 circRNA。 BSJ-gRNA 文库构建（图源：Nature Methods 官网） 研究团队将 BSJ-gRNA-RfxCas13d-HT29 细胞转移到裸鼠体内进行体内功能缺失（loss-of-function，LOF）表型筛筛选，注射 22 天后
诺奖得主 Science 发文：基因编辑诞生 10 年，未来将如何改变世界？
3D）。 目前，存在多种用于哺乳动物系统中 CRISPR 基因编辑的递送方式，广泛划分为进入物理递送、基于病毒的递送，以及基于合成材料的递送。常见的物理递送方法包括显微注射和电穿孔，允许控制剂量，效率递送高，但仅限于离体递送。基于病毒的递送方式包括腺病毒、腺相关病毒和慢病毒，它们以质粒 DNA 的形式通过载体传播，具有良好的效率。基于合成材料的递送方法更安全且有高水平的控制和灵活性，但其效率要低于病毒, 递送效率受到材料的体积和阳离子性质的限制，易导致间质分散不良。 因此，改进当前的递送
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