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云舟生物科技(广州)股份有限公司
提供定制载体及辅助载体
CRISPR / Cas9载体是几种新兴的基因组编辑工具之一,可以在基因组的靶位点快速有效地创建突变(另外两种流行的是ZFN和TALEN)。
Cas9是一类RNA引导的DNA核酸酶的成员,它们是天然原核免疫系统的一部分,可赋予对外来遗传元素(如质粒和噬菌体)的抗性。在细胞内,Cas9酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,通过与基因组中同源的18-22nt靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点的杂交定位Cas9,然后切割基因组中的靶位点。
为了实现CRISPR介导的基因靶向,靶细胞必须同时共表达Cas9和靶位点特异性gRNA。这可以通过表达来自同一载体(又名多合一载体)的Cas9和gRNA序列或使用单独的载体来驱动Cas9和gRNA表达(分别是仅Cas9和仅gRNA载体)来实现。与一体化载体相比,使用单独的载体表达Cas9和gRNA的优势在于,根据用户的实验目标,它可以灵活地组合使用不同的gRNA表达载体与各种Cas9变体(野生型核酸酶、切口酶、核酸酶死)。此外,使用单独的仅gRNA载体允许稳定表达高水平Cas9的细胞或生物体转染针对同一基因或不同基因的不同gRNA序列。这为比较不同gRNA序列在具有可比和高水平的Cas9表达的细胞或生物体中CRISPR介导的基因靶向并行的效率提供了机会。
piggyBac gRNA表达载体对于实现转染介导的靶位点特异性gRNA序列永久引入哺乳动物细胞宿主基因组非常有效。piggyBac系统包含两个载体,均被设计为大肠杆菌质粒。一种载体,称为辅助质粒,编码转座酶。另一种载体称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs),包围着要转座的区域。在载体构建过程中,由驱动靶位点特异性gRNA序列的人U6启动子组成的gRNA表达盒被克隆到该区域。当辅助质粒和转座子质粒共转染到靶细胞中时,辅助质粒产生的转座酶将识别转座子上的两个TR,并将包括两个TR在内的侧翼区域插入宿主基因组。插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点,该序列在整合片段的两侧复制。
我们的piggyBac gRNA表达载体可用于表达单gRNA或双gRNA。虽然单gRNA载体广泛用于传统的CRISPR基因组编辑应用,例如产生单基因敲除,但双gRNA载体对于需要同时靶向一对基因组位点的应用是必要的。此类应用的示例包括:1)配对的Cas9切口酶实验,其中hCas9的“切口酶”突变形式(hCas10-D9A)与靶向单个靶位点的两条相反链的两个gRNA结合使用,以在每条链上产生单链切割一个,从而导致DSB的靶向特异性高于单个gRNA;2)在一对gRNA靶向的两个DSB之间产生片段的缺失;3)同时靶向两个不同的基因。单个 gRNA 载体由驱动两个 TR 之间的靶位点特异性 gRNA 序列的单个人 U6 启动子组成,而双 gRNA 载体由两个连续的 U6 启动子组成,驱动特定于两个目标基因组靶位点的 gRNA 序列的表达。
PiggyBac是II类转座子,这意味着它以剪切和粘贴的方式移动,从一个地方跳到另一个地方而不会留下副本。(相比之下,I 类转座子以复制和粘贴的方式移动。因为辅助质粒只是短暂地转染到宿主细胞中,所以它会随着时间的推移而丢失。随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主细胞基因组中的整合成为永久性的。如果这些细胞再次用辅助质粒转染,转座子可能会从某些细胞的基因组中切除,没有足迹。
亮点
我们的piggyBac gRNA表达载体和辅助质粒经过优化,可在大肠杆菌中进行高拷贝数复制,高效转染到各种靶细胞中,以及载体上携带的转基因的高水平表达。piggyBac gRNA表达载体旨在驱动来自人U6启动子的用户选择的gRNA序列的高水平组成转录,以便在与Cas9核酸酶结合使用时实现高效的CRISPR靶向。该载体可用于表达单gRNA或双gRNA,使用户能够根据其实验目标靶向一个或两个感兴趣的基因组靶位点。
灵活性: 我们的piggyBac gRNA表达载体可与各种Cas9变体(核酸酶、切口酶、核酸酶死)结合使用,具体取决于用户的实验目标。此外,该载体可用于表达单gRNA或双gRNA,使用户能够靶向一个或两个感兴趣的基因组靶位点。
载体DNA的永久整合: 传统转染导致DNA几乎完全瞬时递送到宿主细胞中,因为DNA会随着时间的推移而丢失。这个问题在快速分裂的细胞中尤为突出。相比之下,由于转座子整合到宿主基因组中,将哺乳动物细胞与piggyBac转座子质粒和辅助质粒一起转染可以将转座子上携带的基因永久递送到宿主细胞中。
技术简单: 通过传统转染将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单,并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
有限的细胞类型范围:将piggyBac载体递送到细胞中依赖于转染。转染效率因细胞类型而异。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞通常比永生化细胞系更难转染。众所周知,一些重要的细胞类型,如神经元和胰β细胞,很难转染。此外,质粒转染在很大程度上仅限于体外应用,很少在体内使用。这些问题限制了piggyBac系统的使用。
PAM 要求:基于CRISPR/Cas9的靶向依赖于对位于gRNA识别序列3'末端的原间隔相邻基序(PAM)的严格要求。所需的PAM序列因所使用的Cas9变体而异。
载体关键元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.
U6 Promoter: Drives expression of the downstream gRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.
U6 Promoter: Drives expression of the downstream gRNA sequence. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA #1: The first guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
gRNA #2: The second guide RNA compatible with the Cas9 variant being used.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
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引用 | 主题 |
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科学。339:819 (2013) | 使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的描述 |
细胞。154:1380–9 (2013) | 使用 Cas9 D10A 双切口提高特异性 |
美国国家科学院院刊 114:722 (2017) | 使用piggyBac gRNA表达载体靶向CRISPR/Cas9 |
普洛斯一号。12: e0187236 (2017) | 用于双 gRNA 表达的 CRISPR/Cas9 载体 |