HB-infusion无缝克隆试剂盒

HB-infusion^TM无缝克隆试剂盒
 

   

图1. HB-infusion^TM快速克隆试剂盒原理示意图

 

图2. PCR法线性化载体示意图。

      在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段。
      选取合适的位点，设计正向和反向引物直接进行载体质粒的PCR扩增，一般载体长度均大于3kb，建议采用高保真的DNA聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议对PCR扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。
 

1.2. 目的插入片段制备

     设计引物进行目的片段PCR扩增，引物设计要保证目的片段两端有至少15~20bp序列与线性化载体的两端一致便于连接反应的进行。PCR引物包括5’端与载体同源的15~20bp以及目的片段特异性序列20~25bp（见下图3）
 
 
图3. 采用HB-infiusion^TM试剂盒时PCR上下游引物设计示例。

      针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR引物，其重叠区域为15bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是PCR法线性化载体，扩增插入片段的PCR引

      5’端直接设计成与线性化载体末端15~20 bp重叠即可。

 
 
2.冰上融化并且充分混匀HB-infusion^TM Master mix，配制反应体系
 

 

3. 上述反应体系置于50℃孵育20 min（2-3个片段拼接）/60 min（4-6个片段拼接）。反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂储存于-20℃
4. 转化感受态菌
    4.1. 在冰上融化一支50 ml的DH5a感受态菌(配合汉恒生物专门为该试剂盒研制的感受态细胞，效果更佳)。
    4.2. 取2 ml 第3步中的反应样品加入融化好的感受态菌中，轻轻混匀，不能震荡混匀。将该混合物置于冰上30 min。
    4.3. 轻轻摇匀后放入42℃水浴中1~2 min进行热激，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
    4.4. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h，摇床转速250 rpm。
    4.5. 在超净工作台中取上述转化混合液100~300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。37℃培养箱中培养过夜。
    4.6. 挑取平板上的克隆进行PCR或者酶切鉴定。