Easy Cloning无缝克隆试剂盒

产品简介

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。

汉恒生物研发的Easy Cloning无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段 PCR 引物的 5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的 15~25 bp 同源序列。将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的 PCR 片段按合适比例混合，并加入 Easy Cloning Master mix，通过反应体系中 DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在 50℃反应 20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近 100%。

图. Easy Cloning快速克隆试剂盒原理示意图

1. 线性化目的载体（左上）；

2. PCR 获取目的片段。设计的引物５’需要和线性化载体末端有 15-25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段）；

3. 按照一定比例把二者混合在Easy Cloning的2X预混液内，50℃反应20min后直接转化E.coli即可。

 

产品优势

 

技术对比

 

无缝克隆	传统酶连法克隆
只需要一次反应即可完成定向克隆， 省略酶切、连接等过程	PCR引物设计需引入载体上的酶切位点， PCR产物再经过酶切、胶回收、连接后定向克隆到目的载体上；或进行TA载体连接
对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点	需要查找合适的酶切位点 购买各种内切酶
连接片段之间不会引入任何其他序列	阳性率低
可以同时克隆多个片段	多个片段，通常只能分多次拼接

 

产品包装

 

产品组成	使用次数	体积
2 x Easy Cloning Master mix	20tests	200uL
Positive linearized pUC vector （250 ng）	5tests	25uL
Positive control insert (500 ng)	5tests	25uL
储存条件	-20℃

操作步骤

详细操作步骤请参考汉恒生物官方说明书（可在官网"资料中心→资料下载"获取）

常见问题

一、为什么菌落PCR验证有条带，但质粒PCR无条带？

1. 先检查质粒，测浓度和纯度，确认质粒是否抽提成功；

2. 再检查PCR条件是否无误，例如是否漏加试剂或引物等；

3. 菌落PCR存在假阳性的可能，挑几个新的菌落抽提质粒，重新进行检测。

二、如何选择最佳克隆位点？

克隆位点上下游20 bp区域内GC含量尽量在40%-60%范围内，避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。

三、线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？

会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应，均建议进行割胶回收纯化产物。

四、假阳性率很高，挑不到含目的基因的菌落，可能原因有哪些？

1. 载体线性化不完全，可以通过加大内切酶的使用量、延长酶切反应时间，并使用胶回收纯化酶切产物等操作进行优化。

2. 平板抗性不足，先检查平板抗性，若无问题则考虑抗生素失活问题，建议使用新制备的抗生素平板。

五、阳性对照不长菌可能原因有哪些，怎么解决？

1. 重组酶失活，建议更换新批次酶，全程冰上操作；

2. 感受态细胞失效，建议用确认无误的相同抗性质粒转化，验证效率；

3. 抗生素平板失效，使用新制平板并确认抗生素浓度；

4. 试剂盒保存不当，可能导致阳性对照片段发生降解。