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- xuanya
- 中国/美国
- XY-TE-0717
- 2025年11月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
常温运输和保存
- 保质期：
两年
- 英文名：
Instant PCR Kit 2.0
- 库存：
950
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本产品是在本公司即用型PCR试剂盒2.0的基础上改良而来，内含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分,用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应,具有广泛的用途。
1.扩增效率和灵敏度更高。
2.方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。
3.快捷，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
4.本产品A型含电泳染料,PCR反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
5.产物可直接用于T载体克隆，不需要额外的加A反应。
6.染料单独提供，方便客户组合。
即用型PCR试剂盒2.0注：本产品分A和B两种
A型产品：PCRMagicMix3.0中直接加入了专用染料，PCR后可以直接电泳；
B型产品：PCRMagicMix3.0中没有加入专用染料，客户自己提供染料。
即用型PCR试剂盒2.0运输及保存：
低温运输，-20℃保存,有效期一年。
自备试剂：DNA模板、引物、超纯水。
即用型PCR试剂盒2.0使用方法
以30uL的标准PCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分：
PCRMagicMix3.0 15uL
DNA模板(自备)
哺乳动物基因组DNA 0.5-1ug
酵母基因组DNA 5-500ng
细菌基因组DNA 0.5-50ng
质粒DNA 5-500pg
PCR回收片段 1-100pg
PCR引物(自备) 10pmol each
补水到 30uL
放入PCR仪中进行PCR,结束后取5-10uL直接上样电泳（A型产品不需要额外再加DNA上样液）,红色染料电泳速度相当于50bpDNA片段。
即用型PCR试剂盒2.0注意：
1．如果反应体系不是30uL，各成分需要等按比例增加或减少。
2．如果DNA模板中有PCR不明抑制物（植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物），可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物清除剂（30uL体系中加3uL），可能会对PCR有帮助。
即用型PCR试剂盒2.0相关资料
PCR反应的影响因素
变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃20~30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。
即用型PCR试剂盒2.0退火温度与时间：
退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30~60秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。
即用型PCR试剂盒2.0延伸温度与时间：
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2Kb片段，若使用Taq酶只需1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
即用型PCR试剂盒2.0循环次数：
可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
即用型PCR试剂盒2.0酶量：
50μL反应体系可用0.5-5U酶，酶量的选择与模板DNA的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。
即用型PCR试剂盒2.0模板：
模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1μg为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。
即用型PCR试剂盒2.0引物：
引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有GC，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2μM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。
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文献和实验tga tct cca ggg cac att cct＜3’Tm值分别是61.8、62.0扩增产物139bpPCR体系：Talara公司PCR试剂盒DdH2O 11.6μl10×RNA PCR Buffer 2.0μlMgCl2 2.4μldNTP (10mM) 0.8μlPrimerUP(20μM) 0.4μlPrimerDOWN(20μM) 0.4μlTaqenzyme (1unit/μl) 0.4μlTemplate 2.0μlTotal volume 20μl反应条件：94℃变性 2分钟94
(2.5 mM each) 1.0 ul 32P-dCTP (5 uCi) 1.0 ul RNasin-Pharmacia 2.0 ul SuperScript II RT (200 U/ul)(Gibco BRL # 18064-014) 5.0 ul Retrotherm RT (1 U/ul) (Epicentre Technologies # R19250) 16.0 ul H20 ----------------- 50 ul * These buffers
，切除标签，并通过质谱仪检测。如果你们实验室没有质谱仪，而又想开展多重分析，那么下面的一些方案可能适合你。 罗氏应用科学部的Light Cycler 480 Probes Master Mix能成功支持4重反应，甚至达到5重。这是一种即用型的反应预混液，包含了FastStart Taq 热启动型DNA聚合酶，它能减少非特异产物的形成，从而显著改善PCR的特异性和灵敏度。 Bio-Rad的iQ Multiplex Powermix能检测最多4个目标，即使它们的表达量相差106倍
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