H2O2过氧化氢检测荧光探针

H2O2过氧化氢检测荧光探针
（Hydrogen Peroxide Probes）
H2DCFDA和OxiVision Green™  H₂O₂ Probe
过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）是一种反应氧代谢副产物，用于许多氧化应激相关态的关键调节剂，参与大量生理活动，比如哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变，肥胖症，许多神经衰退疾病和唐氏综合症。也许H2O2过氧化氢最令人兴奋的生理作用在于近期报道，能转化分子氧为过氧化氢的抗体有助于免疫系统的正常识别和攻击。为此，H2O2过氧化氢的检测能够帮助研究者确定氧化应激是如何调控各种胞内信号通路的？ 

• H2DCFDA(DCFH-DA, DCFH)，英文全名2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全名2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，是一种通用的氧化应激指示剂。具细胞膜渗透性，本身无荧光。一旦进入细胞后，被细胞酯酶水解生成2',7'-二氯二氢荧光素并进一步被氧化生成强荧光的2',7'-二氯荧光素（DHF），可用荧光光谱检测（Ex/Em=504/529nm）。H2DCFDA与胞内氧化应激产生的多种活性氧都有反应，包括过氧化氢（H2O2），过氧基（ROO•）和过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。H2DCFDA普遍用来监测细胞氧化还原过程。 

图1. H2DCFDA光谱图 

• OxiVision Green™  H2O2 Probe是一款过氧化氢（H2O2）选择性探针。探针本身无荧光，可见光区域内无吸收峰。一旦接触H2O2，瞬间激发荧光增加并伴随可见波长吸收带的生成（Ex/Em= 490/514nm）。因其二元的吸收/发射荧光反应，此探针具有较大的动力学范围。与相似的ROS比如O2–，NO，或OCl-相比，ROSGreenTMH2O2Probe对H2O2呈现出＞100倍（100-fold）的选择性。

使用方法：
1.准备OxiVision Green™过氧化氢探针：
1.1     在高质量无水DMSO中制备2至5 mM OxiVision Green™过氧化氢探针原液。应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并冷冻于-20 ^Ô C.
注意：避免反复冻融循环。
1.2     准备2X OxiVision Green™过氧化氢探针工作溶液：在 实验当天，将OxiVision Green™过氧化氢探针固体溶解在DMSO中，或将等分试样的探针原液溶解至室温。在20 mM Hepes缓冲液或您选择的缓冲液（pH 7）中制备浓度范围为2至20μM的2X工作溶液。建议使用最终浓度为5μM的OxiVision Green™过氧化氢探针测量溶液中的H ₂O ₂浓度。
 2. 在上清液中运行H ₂ O ₂测定：
2.1     将50μL的2X OxiVision Green™过氧化氢探针工作溶液（来自步骤1.2）添加到H ₂ O ₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总 H ₂ O ₂测定体积为  100μL /好。
注意：对于384孔板中，添加样品的25μL和25μL 2X OxiVision绿色™过氧化氢探针工作液到每个孔中。
2.2     在室温下孵育反应15至60分钟，避光。
2.3     用Ex / Em = 490 / 525nm 的荧光板读数器监测荧光增加。
2.4     空白孔中的荧光（仅含测定缓冲液）用作对照，并从具有H ₂ O ₂反应的那些孔的值中减去。 
3. 在活细胞中运行H ₂ O ₂测定：
OxiVision Green™过氧化氢探针可被动加载到活细胞中，并报告细胞内H ₂ O ₂浓度的微摩尔变化。以下是建议的显微镜成像方案，可根据您的具体研究需要进行修改。
3.1     所述的OxiVision绿色™过氧化氢探针的工作溶液应该作为步骤1.2来制备。建议仅使用含有20 mM Hepes缓冲液的PBS或Hanks平衡盐溶液（HBSS）代替20 mM Hepes缓冲液。
3.2     根据需要处理细胞。
3.3     用 OxiVision Green™过氧化氢探针 工作溶液孵育细胞5至60分钟或所需的一段时间。用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
3.4     使用具有底部读取模式的荧光读板器监测Ex / Em = 490 / 525nm 处的荧光增加。或者使用FITC通道通过荧光显微镜检查荧光变化。
订购信息： 

品牌	货号	名称	规格	价格（元）
BioVision	K936-100	Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）检测试剂盒	100T	2220
BioVision	K936-100	Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）检测试剂盒	250T	2800
Tocris Bioscience	59-351-00	H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧（ROS）荧光探针	100mg	1250
Invitrogen	D399	Molecular Probes™ H2DCFDA (H2-DCF, DCF)	100mg	1720
AATbio	21505-1MG	OxiVisionGreen™  H2O2 Probe过氧化氢荧光探针	1mg	1200