SNP检测

一、技术简介
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。它包括单碱基的转换，颠换、插入及缺失等形式。为适应日益增长的SNP研究需求，和各类客户的不同需要，我们利用多套技术方案为不同客户提供量身定做的个性化服务。
1、直接测序法
在所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP分析的金标准。纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。该技术主要通过直接测序的方法来确定位点的基因型，这种分型方法准确性最高，但费用大。如果需要检测的几个SNP位点正好位于一个测序单元内(长度小于700bp)，则单个位点的分型费用可显著降低，这种分型技术不失为一种良好选择。对于准确性要求特别高或样本量特别小(几个或几十个)的项目，这种分型技术很适合。
 
2、PCR-RFLP分型法
PCR-RFLP是SNP分型最经典的研究方法，具有最大优势在于，不需要有特殊的仪器，检测操作简单，费用低廉，也适合中量样本的检测。缺点是需要大量人力，耗时相对较长，不适合高通量大样本检测。结合RFLP生物软件，不仅能够对有酶切位点的SNP 进行分型，对于不存在合适酶切位点的SNP位点，可通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，使该位点变成常见酶切位点，实现绝大多数SNP位点用RFLP来分析。
 
3、TaqMan探针分型法（定量PCR）
该技术是由美国应用生物系统公司(ABI)研发的SNP分型技术，其技术原理如下：PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的MGB特异探针来识别不同的等位基因(allele1和allele2)，5′端为报告荧光基团(reporter)，3′端为淬灭荧光基团 (quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因结合后，DNA聚合酶发挥5′到3′外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离3′端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光。两个探针的5′端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3′端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。
 
4、Multiplex SNaPshot分型法
该技术由美国应用生物公司（ABI）开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。

二、实验流程
1. 直接测序法
1）样品基因组DNA提取。 
2）根据不同的区域进行引物设计、合成。 
3）对所有样品进行基因扩增并纯化。
4）测序。
5）统计与分析。
2. PCR-RFLP分型法
1）PCR反应。
2）PCR产物的酶切。
3）琼脂糖凝胶电泳检测。
3. TaqMan探针分型法（定量PCR）
1）DNA抽提和质检。
2）引物/TaqMan探针设计与合成。
3）荧光定量PCR检测。
4）测序。
5）统计与分析。
4. Multiplex SNaPshot分型法
1）DNA抽提和质检。
2）扩增、延伸引物的设计合成。
3）扩增和延伸反应。
4）测序仪测序。
5）数据统计与分析。
三、服务说明及结果
1. 直接测序法
1）客户提供：血液样品、组织样品、细胞、菌液等；目的SNP位点的rs号或该位点上下游各200bp的序列以及突变的类型。
2）公司提供：实验流程、电泳图、测序图谱、SNP基因型统计结果等。
3）实验周期：15个工作日。
2. PCR-RFLP分型法
1）客户提供：血液样品、组织样品、细胞、菌液等；PCR-RFLP检测引物和序列信息；目的SNP位点的rs号或该位点上下游各200bp的序列以及突变的类型。
2）公司提供：酶切电泳图；统计分析结果；完整实验报告。
3）实验周期：20-25个工作日。
3. TaqMan探针分型法（定量PCR）
1）客户提供：血液样品、组织样品、细胞、菌液等；目的SNP位点的rs号或该位点上下游各200bp的序列以及突变的类型。
2）公司提供：实验流程；电泳图；定量PCR结果；SNP分型统计结果。 
3）实验周期：20-25个工作日。
4. Multiplex SNaPshot分型法
1）客户提供：血液样品、组织样品、细胞、菌液等；目的SNP位点的rs号或该位点上下游各200bp的序列以及突变的类型。
2）公司提供：实验过程及其涉及的电泳图、酶切图、测序峰型图；SNP分型统计结果。
3）实验周期：20-25个工作日。

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