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- 2025年07月10日
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天津津科生物科技有限责任公司
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免疫组化实验
一）目的和原理
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学
（二）仪器设备
1）湿盒；
2）烘箱（或恒温摇床）；
3）显微镜；
4）PAP Pen；
5）多聚赖氨酸处理过的玻片；
（三）
1）固定液：4%甲醛；
2）0.01M (pH7.4) 的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释和洗片子用；
3）抗原修复液：（柠檬酸盐缓冲液）
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9mL A液+41mL B液+450mL 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
4）酶消化液： a.0.1% 胰蛋白酶液：用0.1% CaCl2(pH7.8) 配制。
b.0.4% 胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制；
5）二甲苯；
6）梯度乙醇；
7）0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4mL + 400mL 纯甲醇→充分混匀H2O2灭活内源性
过氧化物酶；
8）1%～10%血清清蛋白封闭液；
9）显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用
NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；
10）封片液－中性树胶
（四）操作流程 （用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片）
1）组织的固定：将新鲜的组织置于PBS中冲洗（尽量去除血细胞），然后置于4％
甲醛溶液中固定
2）石蜡组织切片的制备（由省人医或者铁医完成）
3）脱蜡：依据相似相溶原理，依次将载玻片放入二甲苯1（45℃）-二甲苯2（40℃）-二甲苯3（40℃）-二甲苯4（40℃），一般在每个试剂中放10min, 天气热可以少放几分钟, 相反, 天气较冷的话, 就要适当延长脱蜡时间, 一般为 12-15min.
4）水化：依次将载玻片放入100%酒精-100%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，每
个试剂中放置5min
5）抗原修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，
放入组织芯片加热10～15分钟，冷却至室温，PBS洗3次，每次5min。
蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
6）用PAP Pen圈定组织范围
7）除去内源性的过氧化氢酶：加入3%H2O2浸泡10min，然后用吸水纸吸掉H2O2，
PBS洗3次，每次5min
8) 血清封闭：擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭
起来，然后放入湿盒中常温封闭30min。血清稀释10倍
9) 加一抗：将湿盒中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血
清，加一抗，如果作对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后放于湿盒
中37°C 1h后4°C冰箱中保存过夜。
10) 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周
围的PBS后加二抗, 然后置于湿盒中30min。
11) 加SABC：将片子从湿盒中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
的PBS后加上SABC, 然后置于湿盒中30min。SABC稀释100倍
12) 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在0.85mL双蒸水中加0.05mL显色剂A，
然后加0.05mL显色剂B，最后加0.05mL显色剂C，摇匀，避光保存）
13) 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物
组织为5～10min。
14) 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放
下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学
（二）仪器设备
1）湿盒；
2）烘箱（或恒温摇床）；
3）显微镜；
4）PAP Pen；
5）多聚赖氨酸处理过的玻片；
（三）
1）固定液：4%甲醛；
2）0.01M (pH7.4) 的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释和洗片子用；
3）抗原修复液：（柠檬酸盐缓冲液）
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9mL A液+41mL B液+450mL 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
4）酶消化液： a.0.1% 胰蛋白酶液：用0.1% CaCl2(pH7.8) 配制。
b.0.4% 胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制；
5）二甲苯；
6）梯度乙醇；
7）0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4mL + 400mL 纯甲醇→充分混匀H2O2灭活内源性
过氧化物酶；
8）1%～10%血清清蛋白封闭液；
9）显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用
NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；
10）封片液－中性树胶
（四）操作流程 （用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片）
1）组织的固定：将新鲜的组织置于PBS中冲洗（尽量去除血细胞），然后置于4％
甲醛溶液中固定
2）石蜡组织切片的制备（由省人医或者铁医完成）
3）脱蜡：依据相似相溶原理，依次将载玻片放入二甲苯1（45℃）-二甲苯2（40℃）-二甲苯3（40℃）-二甲苯4（40℃），一般在每个试剂中放10min, 天气热可以少放几分钟, 相反, 天气较冷的话, 就要适当延长脱蜡时间, 一般为 12-15min.
4）水化：依次将载玻片放入100%酒精-100%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，每
个试剂中放置5min
5）抗原修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，
放入组织芯片加热10～15分钟，冷却至室温，PBS洗3次，每次5min。
蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
6）用PAP Pen圈定组织范围
7）除去内源性的过氧化氢酶：加入3%H2O2浸泡10min，然后用吸水纸吸掉H2O2，
PBS洗3次，每次5min
8) 血清封闭：擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭
起来，然后放入湿盒中常温封闭30min。血清稀释10倍
9) 加一抗：将湿盒中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血
清，加一抗，如果作对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后放于湿盒
中37°C 1h后4°C冰箱中保存过夜。
10) 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周
围的PBS后加二抗, 然后置于湿盒中30min。
11) 加SABC：将片子从湿盒中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
的PBS后加上SABC, 然后置于湿盒中30min。SABC稀释100倍
12) 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在0.85mL双蒸水中加0.05mL显色剂A，
然后加0.05mL显色剂B，最后加0.05mL显色剂C，摇匀，避光保存）
13) 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物
组织为5～10min。
14) 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放
下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
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文献和实验相关实验
性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加 PBS。加完一抗后于 4 °C湿盒中孵育过夜。（抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定，时间控制在 15h 以上）。 PBS 冲洗切片 3 次，每次 3 min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ，37 ℃ 孵育 30 min。 信号检测 PBS 冲洗切片 4 次，每次 3 min，甩去 PBS 液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间
免疫组化（IHC）实验流程。
免疫组化技术是病理科主要的辅助诊断技术之一，质量控制要求严格，目前病理技术人员关注的焦点一般在操作流程及抗体质量上，而一直忽视实验用水的质量问题。 免疫组化实验流程较多，常涉及烤片，脱蜡，水化，抗原修复，抗体孵育，显色，复染，脱水及封片。实验用水常为蒸馏水或纯水，其中蒸馏水是将水蒸馏后去除电解质及与水沸点相差较大的非电解质，如屈臣氏饮用水; 而纯水则利用反渗透法去掉了水中的全部非水物质(全部电解质与非电解质) ，是一种偏酸(pH 6.0) 、硬度及矿物元素水平极低的软水。
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