免疫组化实验

一）目的和原理
  免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学
（二）仪器设备
       1）湿盒；
      2）烘箱（或恒温摇床）；
      3）显微镜；
      4）PAP Pen；
      5）多聚赖氨酸处理过的玻片；
（三）
      1）固定液：4%甲醛；
      2）0.01M (pH7.4) 的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释和洗片子用；
      3）抗原修复液：（柠檬酸盐缓冲液）
          贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
                  0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
         工作液：9mL A液+41mL B液+450mL 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
      4）酶消化液：    a.0.1% 胰蛋白酶液：用0.1% CaCl₂(pH7.8) 配制。
                       b.0.4% 胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制；
      5）二甲苯；
      6）梯度乙醇；
      7）0.03% H₂O₂-甲醇：30% H₂O₂ 0.4mL + 400mL 纯甲醇→充分混匀H₂O₂灭活内源性
         过氧化物酶；
      8）1%～10%血清清蛋白封闭液； 
      9）显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用
         NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；
     10）封片液－中性树胶
（四）操作流程 （用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片）
      1）组织的固定：将新鲜的组织置于PBS中冲洗（尽量去除血细胞），然后置于4％
         甲醛溶液中固定
      2）石蜡组织切片的制备（由省人医或者铁医完成）
      3）脱蜡：依据相似相溶原理，依次将载玻片放入二甲苯1（45℃）-二甲苯2（40℃）-二甲苯3（40℃）-二甲苯4（40℃），一般在每个试剂中放10min, 天气热可以少放几分钟, 相反, 天气较冷的话, 就要适当延长脱蜡时间, 一般为 12-15min.
      4）水化：依次将载玻片放入100%酒精-100%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，每
         个试剂中放置5min
      5）抗原修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，
         放入组织芯片加热10～15分钟，冷却至室温，PBS洗3次，每次5min。
         蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
      6）用PAP Pen圈定组织范围
      7）除去内源性的过氧化氢酶：加入3%H₂O₂浸泡10min，然后用吸水纸吸掉H₂O₂，
         PBS洗3次，每次5min
      8) 血清封闭：擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭
         起来，然后放入湿盒中常温封闭30min。血清稀释10倍
      9) 加一抗：将湿盒中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血
         清，加一抗，如果作对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后放于湿盒
         中37°C 1h后4°C冰箱中保存过夜。
     10) 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周
         围的PBS后加二抗, 然后置于湿盒中30min。
     11) 加SABC：将片子从湿盒中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
         的PBS后加上SABC, 然后置于湿盒中30min。SABC稀释100倍
     12) 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围
         的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在0.85mL双蒸水中加0.05mL显色剂A，
         然后加0.05mL显色剂B，最后加0.05mL显色剂C，摇匀，避光保存） 
     13) 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物
         组织为5～10min。
     14) 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放
         下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。