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- TUNEL细胞凋亡原位检测 （FITC标记POD法,冰冻切片专用）
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- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
天津津科生物科技有限责任公司
- 服务名称：
TUNEL细胞凋亡原位检测 （FITC标记POD法,冰冻切片专用）
FITC标记POD法,冰冻切片专用）
- 目的和原理
- 仪器设备
2）染色缸
3) 离心机
4）普通光学显微镜
2）PBS、
3）H2O2 、
4）TritonX-100、
5）柠檬酸钠、
6）复染苏木素染液
7）凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
（四） 操作流程
1. 检测样本的预处理
a. 冰冻切片的预处理
b. 阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步骤与待测样本同样进行。
A： 阳性对照样本的准备
组织样本（冰冻切片）在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（冰冻切片：2000-3000U DNase I;细胞：1000-2000U DNase I;石蜡切片 3000-5000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）（用户自备）室温～37℃处理10～30 min，其余步骤均相同。如有问题详见Page 7.
B： 阴性对照样本的准备
在Page6标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。
2. 标记和显色反应：
3. 常见问题的原因及推荐解决方案.
*TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol
| 现象 | 可能原因 | 建议 |
| 非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色） | Biotin-dUTP的非特异性结合 | 勿使细胞干涸 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 |
| TdT酶的浓度过高 | 用TdT dilution buffer* 作1：2—1：10稀释 | |
| 内源过氧化物酶未被封闭 | 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| 光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） | 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 | |
| 在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） | 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 | |
| 固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 | 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭 | |
| 染色背景较高 | 福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色 | 尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。 |
| 内源过氧化物酶未被封闭 | 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| Biotin-dUTP的非特异性结合 | 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 | |
| 样本被支原体污染 | 使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本 | |
| 标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高 | 稀释50%，以降低标记反应的浓度 | |
| 细胞处于高度增殖期 | 在非高增殖期取样检测 | |
| DAB孵育时间过长 | 减少DAB染色时间 | |
| 标记率低、染色淡至无 | 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失） | 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福尔马林或戊二醛固定。 |
| 过度的固定导致与蛋白过度交联 | 缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 | |
| 促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 | l 增加通透剂促渗时间 l 增加通透剂的作用温度（15-25℃） l 优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min） l 0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 |
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文献和实验一、TUNEL法的实验原理 细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖
用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。 TUNEL 法的实验原理 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉
荧光素FITC标记抗体的方法（Marsshall法、Chadwick法、改良法、透析标记法）
Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1 ． Marsshall 法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0.5mol／L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50mL小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／L PBS等。 (2)方法及步骤 ①抗体的准备 取适量已知
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