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        石蜡切片免疫组化实验步骤

        Elabscience

        1709

        脱蜡和水化

        1. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。
        2. 再次浸入无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去离子水冲洗2次,每次2 min。

        抗原修复 (可选)

        1. 将组织切片放入修复盒,然后加入适量 0.01M 枸橼酸缓冲液(pH 6.0)或 EDTA 修复液(pH 9.0),液面要浸没组织。
        2. 微波中档修复 10 min(液体沸腾时开始计时),此过程中勿使组织干片。
        3. 将修复盒从微波炉中拿出,自然冷却降温,当修复液降至室温后取出玻片,PBS(pH 7.4)冲洗3遍,每次3 min(冲洗过程中切勿对着组织冲洗,以免弄破组织)。

        灭活

        1. 将配制好的 3 %的过氧化氢(去离子水稀释30%过氧化氢)滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育15 min,PBS 冲洗 3 次,每次 3 min。

        抗体孵育

        1. 吸水纸吸干 PBS,在玻片上滴加 5%的正常血清(与二抗种属来源一致或相似),37 ℃封闭 30 min。
        2. 用吸水纸擦干玻片组织周围的液体,用油性笔在组织周围画圈,然后滴加稀释好的一抗,如果做阴性对照实验,就在对照组的组织上滴加 PBS。加完一抗后于 4 °C湿盒中孵育过夜。(抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定,时间控制在 15h 以上)。
        3. PBS 冲洗切片 3 次,每次 3 min,吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ,37 ℃ 孵育 30 min。

        信号检测

        1. PBS 冲洗切片 4 次,每次 3 min,甩去 PBS 液体后吸水纸擦干切片,每张切片滴加新鲜配制的 DAB 显色液,显微镜下观察,阳性信号为棕黄色或棕褐色,时间要控制好,切勿显色过深。用自来水冲洗切片终止显色。
        2. Harris 苏木素复染,一般 30 s-1 min 左右,水洗后用 1% 的盐酸酒精分化,再用自来水冲洗返蓝。(染核,可选)

        脱水固定封片

        1. 将切片置于水中冲洗后,将切片依次放入:70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明,每个试剂中放置 2 min,最后在通风橱中风干切片。
        2. 将中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上。先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好的切片平躺置于通风橱中晾干。
        3. 晾干的切片可以在显微镜下观察或采集图像。
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