首页 » 技术服务 » 免疫学 » 其它 »  PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测

PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测

 PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测
技术资料: 免费索取技术资料
 丁香通采购保障计划,让您的采购更放心。查看详情

供应商信息

上海信帆生物科技有限公司
商家诚信度:
成立时间:2013
入驻丁香通年限:5年
商家等级:金牌客户
产品信息完整度:61%
联系人:莫女士 点击这里给我发消息

若您通过QQ未能联系到商家,您可以给商家发送站内信,与其取得联系。

扫一扫
微信联系商家

邮件: 1170233632@qq.com

手机:13764793648

电话:021-51870610

地址:上海市闵行区光华路2118号

该商家已通过实名认证
 

产品详情

简介: PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代谢,RT-PCR代测,客户只需提供样本,其余所有试剂均由我司提供
提供商: 上海信帆生物科技有限公司
服务名称: 实时荧光定量PCR检测
地区: 上海

上海信帆生物提供 PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测。客户只需要提供样本,其他所有试剂都由本公司提供。一般7-10天出结果,提供原始数据,分析数据,实验报告,实验室所用仪器型号,图片,动力扩增曲线等。代测费用原价150元,现在6.2折促销,欢迎来电!
 
Real -Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,它是在PCR反应体系中加入荧光物质,并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测,最终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来,广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。
 
PCR实验代测,荧光定量PCR代测服主要仪器及耗材
旋涡振荡器 :上海青浦泸西仪器厂产品
手握式电动匀浆机:德国FLUKO 公司产品
低温冷冻离心机:Sigma(3K15)公司产品
Real-time检测仪:ABI (ABI-7300)公司产品
超纯水分离系统:美国LABCONCO公司
离心管及10μL、200μL、1000μL枪头等常规耗材均为国产;RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的DEPC水浸泡过夜,121℃灭菌30min,烘干后备用。
 
PCR实验代测,荧光定量PCR代测服实验室试剂的操作
1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。
3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。


本程序适用于自动PCR操作,可适用于大多数情况,所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶,如Taq聚合酶等。 
引物(各50pmol) 0.2mmol/L dNTPs(必须使用高质量的dNTPs,这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解,因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等) 模板DNA:约0.05~1mg基因组DNA或0.002~0.02mg质粒DNA Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) 10×PCR缓冲液(500mmol/L KCl,15mmol /L MgCl2,100mmol/L Tris·HCl,pH 8.3) 矿物油 
电泳所需试剂 
【仪器设备】 
PCR扩增仪 
电泳装置 
微量离心机 
微量移液器(1~20ml和20~200ml) 
0.5ml Eppendorf 管 
紫外线观察装置及照相设备

 操作程序 

1.在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物:

2.93℃ 反应2 min后开始以下循环: 
93℃变性反应1 min; 
50℃退火反应1 min; 
72℃延伸反应3 min。 
经过17~35循环后,最后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。 
3.取1~5ml反应产物走凝胶电泳,经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

 
应注意的问题及其解决方法 

1.PCR反应条件的优化 
要优化特定的PCR反应,有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响,从中大家可以得到一些线索以改进反应条件,提高PCR产量和/或特异性,一般情况下,只须改变一两个参数就行了,如pH值和MgCl2浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。 
表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响

反应组分 提高产量 提高特异性
模板浓度 增加 减少
引物浓度 高至75 pmol 低至15 pmol
引物长度 增加
dNTPs 各1 mmol/L 各20 mmol/L
Tris-HCl (10 mmol/L pH8) pH高至10* pH高至10*
MgCl2 高至4 mmol/L 1.5 mmol/L
DMSO 10%**
甘油 2%
甲酰胺 5%
Taq DNA聚合酶*** 高至5U 0.5U


* 效果可能不可预测
** 添加10% DMSO时,Taq DNA聚合酶的活性会被抑制47%,因此反应加大Taq DNA聚合酶的用量(即5U)予以补偿
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改变以提高PCR产物的特异性和/或产量的循环参数

反应条件 提高产量 提高特异性
循环数 最多35个 减至25个
变性* 增至1 min
引物退火** 降至45℃ 升至72℃
引物延伸*** 在后期循环中延长 维持30s


* 使用基因组DNA作模板时,开始几个循环变性应于97℃进行 
** 假定Tm值为60℃ 
*** 延伸时间依产物大小而定:1000bp的产物延伸30s即可,产物更长时,按每1000 bp延伸0.5 min计,在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率
2.引物的设计 
毫无疑问,引物的碱基组成,长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素,选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验,对于某一对引物而言尚无通用的规则可严,但应遵守以下原则: 
(1)一般性原则: 
①长度:15~30bp,其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃),从而降低产物的特异性。 
②G+C含量:应在45%~55%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10度。引物长度小于20时,其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C,否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。 
④ 引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。 
⑤引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。 
⑥特异性:与非特异扩增序列的同源性应小于70%,或少于连续8个的互补碱基。 
(2)引物的3’端: 
引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应,除特殊情况(AS-PCR)外,3’端不应发生错配。S. Kwok等发现,引物的3’端发生错配时,A:A使产量下降至1/20,A:G或C:C下降至1/100。当末位碱基是T时,即使错配也能引发链的合成,而为A时错配的引发效率最低,G、C居间。 
因此,引物的3’端碱基最好选用A、G、C,而尽可能地避免选用T,尤应避免连续出现2个以上的T。 
此外,如果扩增编码区域,引物的3’端不要终止于密码子的第3位,因此处易发生简并,从而影响扩增特异性。 
(3)避开引物的二级结构区: 
某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响,因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区,有些计算机软件可帮助确定该区域,如不能避开,则可用7- deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP,有助于PCR成功。 
目前在引物选择中已广泛应用计算机软件,从EMBL或Genebank中查找有关基因序列,并依据上述原则对所选用引物进行评价。 
3.出现异常结果时的解决思路 
在做PCR反应的过程中,由于其酶促反应的本质,影响最终结果的因素较多,所以出现一些非预料的结果是可以理解的。下面简单地总结一下在PCR反应结果出现异常时我们应该采取的措施。 
(1)电泳检查没有 PCR产物 
a.需检查一下Taq DNA聚合酶是否失活,或是活性太低,还需查一下在加样过程中是否向体系中加过Taq DNA聚合酶; 
b.需检查一下所使用的引物,看其序列设计是否正确,是否碱基组成不平衡; 
c.需要检查一下PCR反应过程中模板是否变性充分,尤其在前几个循环中是否变性充分;可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间;  
d.需检查一下在PCR反应体系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制剂,如SDS污染等等; 
e.需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染,可以预先加热使之失活。 
(2)电泳检查出现引物二聚体区带 
a.需检查一下两个引物的3’端是否互补,或者是否有相类似的回文结构; 
b.需检查一下使用的引物是否太短,可以予以适当的延长; 
c.需检查模板的用量,模板以10-4个拷贝为最佳,模板太少会造成引物相对过量; 
d.适当地降低引物的浓度,引物浓度过高是出现引物二聚体的最主要原因;  
e.循环次数太多也易形成引物二聚体,可以适当地减少循环数;  
f.可以将复性温度提高一些以减少引物二聚体形成。  
(3)电泳检测PCR产物呈片状(smear)  
a.需检查一下Taq DNA聚合酶的用量,适当地减少Taq酶的量有助于特异性条带扩增;  
b.可以提高反应的退火温度,或者直接采用两个温度的PCR(68℃退火和延伸,94℃模板变性);  
c.适当地降低Mg 2+ 的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用;  
d.适当地减少反应退火的时间和延伸的时间;  
e.适当地减少循环次数也会有效果;  
f.可以尝试使用巢式引物PCR(nested primer PCR)。  
(4)电泳检测PCR产物出现其它非特异性条带  
a.需检查一下引物的3’端是否有连续排列的G或C;  
b.可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度PCR方法进行扩增;  
c.可以降低Taq DNA聚合酶的用量,同时也降低引物的浓度;  
d.可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间;  
e.可以适当地增加或减少一些Mg 2+ 浓度。  
4.假阳性  
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。  
预防各种污染的措施主要有:(1)工作区隔离。(2)改进实验操作,如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化,如后加阳性对照等。  
交叉污染的处理方法包括:(1)在DNA模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min(Nature, 1990, 34:27)。(2)PCR实验中使用dUTP,而不用dTTP。在扩增前使用UraciⅠN-glycosylase(尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的PCR产物,而不降解基因组DNA模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应(Gene, 1990, 93: 125)。美国PE公司提供此类试剂盒(PCR carry-over preventionkit)。(3)在PCR反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联 DNA链,使之不能再扩增(Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99)。  
2.2.2.5 PCR技术在分子生药学中的应用  
对于生药学家来说,PCR技术已称为他们研究生药的一种崭新而有力的工具。PCR技术在生药学中的应用主要有两方面:①扩增和直接测序或者对属性特异的DNA序列定性以用于系统发育或亲缘关系的分析,也可用于鉴定品种;②通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物,用于药用植物的基因工程。


PCR实验代测,PCR实验设计,PCR实验--上海信帆生物代做免疫组化实验,WB实验,放免实验,ELISA实验等,提供实验数据,图片,实验报告,欢迎来电咨询。 

相关产品

PCR Water 丁香通标准抗体
品牌:abnova  货号:D0022  应用:PCR技术  价格:¥840.0 - 1740.0 
 机会难得,量大从优!!咨询 15979190352 荧光定量PCR服务产品说明:中洪生物提供快捷高效的实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服务,所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。是一个常用的mRNA水平的基因表达定量技术。 服务内容细胞/组织的基因差异表达检测,经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时段的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。组织/细胞样品中基因拷贝数的确定,DNA或RNA的相对和绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等。基因分型,基因突变及多态性方面的研究。收费标准询价 服务周期1. 从细胞或特定组织中提取总RNA:实验周期为细胞或组织送到后的2个工作日。2. 逆转录实验:实验周期为1个工作日。3. 扩增内参和目的基因,实验周期为10个工作日。因为在每种不同细胞或组织中不同的基因的扩增难度有差异,因此实验的时间会有所不同。我们一般会根据实验进程通知客户,确保客户在第一时间知道实验状况。4. 回收内参和目的基因表达片段做标准样,并检测其扩增效果: 实验周期为2个工作日。5. 上机Real Time-PCR检测得到结果并进行处理: 实验周期为2个工作日。技术原理Real-time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有特异性强,有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点,做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定Ct值,从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。技术流程一、RNA的提取二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA三、RNA琼脂糖凝胶电泳四、RNA反转录为cDNAReal-Time PCR引物设计的要求① Tm=55~65 ℃②
                            Real Time PCR实验检测                                   实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法,具有灵敏度和特异性高、实时和准确等优点。莱博生物拥有市面上最全的实时定量PCR检测平台,能够在转录水平,表观遗传水平以及基因水平等不同层面对客户提供全面,高质量的实时定量PCR技术服务。         Real TimePCR,即荧光定量PCR(qPCR)广泛应用到多种研究实验中,如药物处理前后组织或细胞mRNA表达量变化、基因芯片结果验证、siRNA筛选以及致病微生物定量检测等。我公司提供专业系统准确快捷的RealTime PCR技术服务!           试用说明:帮用户做PCR检测,每个试用人可以申请5个样本,每个样本一个基因       ◇ 服务内容:         1)总RNA提取和质量检测;         2)RNA逆转录为cDNA;         3)免费设计引物/探针,进行qPCR检测,3个重复,内参免费,无需提供任何试剂;         4)实验数据整理和分析。      ◇ 您只需提供:         新鲜足量的标本,或总RNA或DNA(大于5ug/样品),告知待测基因的GeneID,您无需提供任何试剂。      ◇ 我们提供:         免费设计引物/探针,实验报告单,qPCR原始数据(CT值)、样品扩增动力曲线、溶解曲线、数据△△CT法分析。      ◇ 实验周期:2周。      全国免费服务热线:400-058-2536  电话: 020-62876677  传真: 020-62876977  网址: http://www.labedit.com/   莱博客服一: 莱博客服二: 莱博客服三:
  Real Time PCR实时荧光定量PCR Real Time PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光物质,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,对未知模板进行定量分析的方法。因其无需电泳,且具有快速性及定量性而倍受青睐。                   服务项目说明   ■ 定性分析 PCR反应结束后的PCR产物无需电泳检测,可以通过Real Time PCR方法,简单快速地对目的基因进行高特异性、高灵敏度的检测,同时闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染。本技术可以广泛应用于病毒、病原菌等致病微生物的检测以及各种生物品种的鉴定等。   ■ 绝对定量 绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上的标准曲线后,可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量(起始拷贝数)分析。   ■ 相对定量(mRNA表达量分析) 基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和参比基因同时分别进行定量,然后求出对于参比基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较,可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。参比基因通常选用表达量相对恒定的Housekeeping Gene,如:GAPDH、β-actin等。通过同时对参比基因的实时检测,可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正,达到在严
产品简介:              荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。   公司简介:       深圳中洪博元生物技术有限公司是国内领先的生物医学领域科研服务供应商,是提供医学实验技术服务、整体实验外包一站式服务的生物医学类高科技企业      公司内设细胞检测,蛋白检测,基因检测,组织学检测,病毒学服务,微生物服务,动物实验等专业实验室,进行相关领域的技术服务。公司在软、硬件投入上始终坚持高标准、高品质的要求,不断引进、消化、吸收国内外医学科研的先进技术,全力搭建一个优质的医学科研服务平台。公司科研团队具有丰富的科经验,在科学引文索引(SCI)杂志上发表数十篇文章。公司立足于生物医学领域,以客户需求为导向,建立了实验设计和评估、细胞检测,蛋白检测,基因检测,组织学检测,病毒学服务,微生物服务,动物实验、整体课题外包服务等平台,为客户提供最佳的实验设计服务和专业的实验解决方案,帮助客户缩短科研周期、节省试验成本,使客户的科学研究具有持续性。     公司的核心研发团队已经研制出涵盖分子诊断和免疫检测等领域的200多种产品,具体包括临床/科研类荧光定量PCR试剂盒、Elisa检测试剂盒、转基因鉴定系列检测试剂盒等产品。并已经在全国包括北京、上海、广州、成都、杭州、南京、西安、重庆、兰州、郑州、南昌、合肥、武汉、长沙、福州等十多个城市形成分销网络。    公司拥有一流的专业技术人员和雄厚的技术力量,公司现拥有数十位博士、硕士及海归人员,同时拥有多位具有高级职称的专业技术人员。公司目前已与近300余家医疗单位签约合作,分布于全国各地。同时也与多家医学院校展开合作,并得到相关医学院校的好评, 现已成为数所大学院校的实习与就业基地服务流程:深圳中洪博元生物技术有限公司   http://www.chinazglab.com  

数据正在加载,请稍候...

电话: 021-51870610 联系人: 莫女士 (联系我时请说在丁香通看到的)

30秒填写信息,方便商家与您及时沟通

您未登录,马上登录 注册,即可保存询价历史
换一个



询价发送成功

上海信帆生物科技有限公司 会在1个工作日内联系您!

马上登录注册,即可保存询价历史

你可能感兴趣的产品

生物学霸
帮助你升级成为学霸。
查看