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PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测

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 PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测
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  • PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代谢,RT-PCR代测,客户只需提供样本,其余所有试剂均由我司提供
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  • 商家诚信度 
  • 入驻年限  6年
  • 上海市闵行区光华路2118号

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  • 提供商: 上海信帆生物科技有限公司
    服务名称: 实时荧光定量PCR检测

    上海信帆生物提供 PCR实验代测,实时荧光定量PCR实验代测,RT-PCR代测。客户只需要提供样本,其他所有试剂都由本公司提供。一般7-10天出结果,提供原始数据,分析数据,实验报告,实验室所用仪器型号,图片,动力扩增曲线等。代测费用原价150元,现在6.2折促销,欢迎来电!
     
    Real -Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,它是在PCR反应体系中加入荧光物质,并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测,最终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来,广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。
     
    PCR实验代测,荧光定量PCR代测服主要仪器及耗材
    旋涡振荡器 :上海青浦泸西仪器厂产品
    手握式电动匀浆机:德国FLUKO 公司产品
    低温冷冻离心机:Sigma(3K15)公司产品
    Real-time检测仪:ABI (ABI-7300)公司产品
    超纯水分离系统:美国LABCONCO公司
    离心管及10μL、200μL、1000μL枪头等常规耗材均为国产;RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的DEPC水浸泡过夜,121℃灭菌30min,烘干后备用。
     
    PCR实验代测,荧光定量PCR代测服实验室试剂的操作
    1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
    2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。
    3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
    4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
    5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
    6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
    7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。


    本程序适用于自动PCR操作,可适用于大多数情况,所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶,如Taq聚合酶等。 
    引物(各50pmol) 0.2mmol/L dNTPs(必须使用高质量的dNTPs,这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解,因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等) 模板DNA:约0.05~1mg基因组DNA或0.002~0.02mg质粒DNA Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) 10×PCR缓冲液(500mmol/L KCl,15mmol /L MgCl2,100mmol/L Tris·HCl,pH 8.3) 矿物油 
    电泳所需试剂 
    【仪器设备】 
    PCR扩增仪 
    电泳装置 
    微量离心机 
    微量移液器(1~20ml和20~200ml) 
    0.5ml Eppendorf 管 
    紫外线观察装置及照相设备

     操作程序 

    1.在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物:

    2.93℃ 反应2 min后开始以下循环: 
    93℃变性反应1 min; 
    50℃退火反应1 min; 
    72℃延伸反应3 min。 
    经过17~35循环后,最后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。 
    3.取1~5ml反应产物走凝胶电泳,经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

     
    应注意的问题及其解决方法 

    1.PCR反应条件的优化 
    要优化特定的PCR反应,有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响,从中大家可以得到一些线索以改进反应条件,提高PCR产量和/或特异性,一般情况下,只须改变一两个参数就行了,如pH值和MgCl2浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。 
    表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响

    反应组分 提高产量 提高特异性
    模板浓度 增加 减少
    引物浓度 高至75 pmol 低至15 pmol
    引物长度 增加
    dNTPs 各1 mmol/L 各20 mmol/L
    Tris-HCl (10 mmol/L pH8) pH高至10* pH高至10*
    MgCl2 高至4 mmol/L 1.5 mmol/L
    DMSO 10%**
    甘油 2%
    甲酰胺 5%
    Taq DNA聚合酶*** 高至5U 0.5U


    * 效果可能不可预测
    ** 添加10% DMSO时,Taq DNA聚合酶的活性会被抑制47%,因此反应加大Taq DNA聚合酶的用量(即5U)予以补偿
    *** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
    表2-2 可改变以提高PCR产物的特异性和/或产量的循环参数

    反应条件 提高产量 提高特异性
    循环数 最多35个 减至25个
    变性* 增至1 min
    引物退火** 降至45℃ 升至72℃
    引物延伸*** 在后期循环中延长 维持30s


    * 使用基因组DNA作模板时,开始几个循环变性应于97℃进行 
    ** 假定Tm值为60℃ 
    *** 延伸时间依产物大小而定:1000bp的产物延伸30s即可,产物更长时,按每1000 bp延伸0.5 min计,在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率
    2.引物的设计 
    毫无疑问,引物的碱基组成,长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素,选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验,对于某一对引物而言尚无通用的规则可严,但应遵守以下原则: 
    (1)一般性原则: 
    ①长度:15~30bp,其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃),从而降低产物的特异性。 
    ②G+C含量:应在45%~55%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10度。引物长度小于20时,其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
    ③ 碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C,否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。 
    ④ 引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。 
    ⑤引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。 
    ⑥特异性:与非特异扩增序列的同源性应小于70%,或少于连续8个的互补碱基。 
    (2)引物的3’端: 
    引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应,除特殊情况(AS-PCR)外,3’端不应发生错配。S. Kwok等发现,引物的3’端发生错配时,A:A使产量下降至1/20,A:G或C:C下降至1/100。当末位碱基是T时,即使错配也能引发链的合成,而为A时错配的引发效率最低,G、C居间。 
    因此,引物的3’端碱基最好选用A、G、C,而尽可能地避免选用T,尤应避免连续出现2个以上的T。 
    此外,如果扩增编码区域,引物的3’端不要终止于密码子的第3位,因此处易发生简并,从而影响扩增特异性。 
    (3)避开引物的二级结构区: 
    某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响,因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区,有些计算机软件可帮助确定该区域,如不能避开,则可用7- deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP,有助于PCR成功。 
    目前在引物选择中已广泛应用计算机软件,从EMBL或Genebank中查找有关基因序列,并依据上述原则对所选用引物进行评价。 
    3.出现异常结果时的解决思路 
    在做PCR反应的过程中,由于其酶促反应的本质,影响最终结果的因素较多,所以出现一些非预料的结果是可以理解的。下面简单地总结一下在PCR反应结果出现异常时我们应该采取的措施。 
    (1)电泳检查没有 PCR产物 
    a.需检查一下Taq DNA聚合酶是否失活,或是活性太低,还需查一下在加样过程中是否向体系中加过Taq DNA聚合酶; 
    b.需检查一下所使用的引物,看其序列设计是否正确,是否碱基组成不平衡; 
    c.需要检查一下PCR反应过程中模板是否变性充分,尤其在前几个循环中是否变性充分;可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间;  
    d.需检查一下在PCR反应体系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制剂,如SDS污染等等; 
    e.需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染,可以预先加热使之失活。 
    (2)电泳检查出现引物二聚体区带 
    a.需检查一下两个引物的3’端是否互补,或者是否有相类似的回文结构; 
    b.需检查一下使用的引物是否太短,可以予以适当的延长; 
    c.需检查模板的用量,模板以10-4个拷贝为最佳,模板太少会造成引物相对过量; 
    d.适当地降低引物的浓度,引物浓度过高是出现引物二聚体的最主要原因;  
    e.循环次数太多也易形成引物二聚体,可以适当地减少循环数;  
    f.可以将复性温度提高一些以减少引物二聚体形成。  
    (3)电泳检测PCR产物呈片状(smear)  
    a.需检查一下Taq DNA聚合酶的用量,适当地减少Taq酶的量有助于特异性条带扩增;  
    b.可以提高反应的退火温度,或者直接采用两个温度的PCR(68℃退火和延伸,94℃模板变性);  
    c.适当地降低Mg 2+ 的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用;  
    d.适当地减少反应退火的时间和延伸的时间;  
    e.适当地减少循环次数也会有效果;  
    f.可以尝试使用巢式引物PCR(nested primer PCR)。  
    (4)电泳检测PCR产物出现其它非特异性条带  
    a.需检查一下引物的3’端是否有连续排列的G或C;  
    b.可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度PCR方法进行扩增;  
    c.可以降低Taq DNA聚合酶的用量,同时也降低引物的浓度;  
    d.可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间;  
    e.可以适当地增加或减少一些Mg 2+ 浓度。  
    4.假阳性  
    实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。  
    预防各种污染的措施主要有:(1)工作区隔离。(2)改进实验操作,如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化,如后加阳性对照等。  
    交叉污染的处理方法包括:(1)在DNA模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min(Nature, 1990, 34:27)。(2)PCR实验中使用dUTP,而不用dTTP。在扩增前使用UraciⅠN-glycosylase(尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的PCR产物,而不降解基因组DNA模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应(Gene, 1990, 93: 125)。美国PE公司提供此类试剂盒(PCR carry-over preventionkit)。(3)在PCR反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联 DNA链,使之不能再扩增(Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99)。  
    2.2.2.5 PCR技术在分子生药学中的应用  
    对于生药学家来说,PCR技术已称为他们研究生药的一种崭新而有力的工具。PCR技术在生药学中的应用主要有两方面:①扩增和直接测序或者对属性特异的DNA序列定性以用于系统发育或亲缘关系的分析,也可用于鉴定品种;②通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物,用于药用植物的基因工程。


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