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文献和实验上篇我们对经典分子克隆技术和无缝组装克隆技术进行了比较,经典分子克隆兜兜转转、如琢如磨,而无缝组装克隆技术却能做到操作简单和方便快捷。那它究竟是如何实现的呢?本期我们就来具体聊聊无缝克隆的四步致胜奇招。 无缝组装克隆之 Step 123——带你飞,把还在用传统方法“琢磨”的他甩在后面 基于同源序列的无缝组装克隆技术,关键是利用 PCR 引物,在目标片段两端引入与线性化载体两端同源的一段序列。基本策略是 选定插入外源片段的位置,以此线性化载体 设计包含线性化载体两端序列和目标片段两端序列的引物
1. 质粒载体构建不成功(目的片段和载体不能成功连接)的常见原因分析 ①DNA 片段纯度差:体系中的杂质会降低连接效率,如果使用不纯化直接连接的方法一直无法成功构建载体,可以考虑进行纯化后再进行连接; ②目的片段和载体片段使用比例悬殊,或者用量过多或过少:目的片段和载体的摩尔比需要控制在一定范围之内,否则会影响连接效率,具体比例可以草靠连接酶说明书; ③连接条件不当:比如连接时间不足、温度不合适、酶失活等,可以通过设置对照组来排查原因; ④引物设计问题:比如通过无缝克隆的方式进行连接,同源
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