无缝克隆试剂盒（Gibson原理）

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产品货号：D0204P
储存条件：-20℃
产品组分

产品简介
基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。
DNA Assembly MixPLUS无缝克隆试剂盒最快仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。Mix中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。
实验步骤
 
2、线性化克隆载体制备
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。
① 酶切制备
推荐使用LabFD™快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景(假阳性克隆)；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。
注1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；
注2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
② 反向 PCR 扩增制备
为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

3、插入片段PCR引物设计
PCR引物的5' 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18nt）序列。假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。
插入片段正向扩增引物：
5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+ 基因特异性正向扩增序列— 3'
插入片段反向扩增引物：
3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'
注1：尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25 nt区域内GC含量为40%~60%时，重组效率最高；
 
注2：本试剂盒所提供的 pUC 19 载体（Ampr）连接端序列如下：
 
4、插入片段的 PCR 扩增
推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5、重组反应
①于冰水浴中配置以下反应体系：

a.最适载体用量(ng)=0.02×载体碱基对数，即0.03pmol。
b.插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04×片段碱基对数；
插入多片段，每片段最适用量（ng）= 0.02×片段碱基对数。
注1：若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；
注2：若插入片段的长度小于200 bp，则插入片段应使用5倍载体用量；
注3：若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用；
注4：载体片段过长、插入片段过长克隆阳性率均会降低。
重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。
② 将反应体系置于50℃，反应5~60min。
注1：推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；
注2：插入1-2个片段时，推荐反应时间5-15min，插入3-5个片段时，推荐反应时间15-30min；
注3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上时，建议延长反应时间到30-60min
注4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。
③ 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。
注1：-20℃储存的重组产物，建议在1周内使用。

6、重组产物转化
取5~10μl反应液，加入到100 μl感受态细胞中缓慢吸打混匀，冰上放置30min。42℃热激45~60sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养40~60min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。
注1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>108 CFU/μg的感受态细胞；
注2：菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度；
注3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。

7、阳性克隆检测
挑取单菌落至10 μl ddH2O中混匀，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。
注1：菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；
注2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

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