AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）的AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一种结合 RFLP 和 PCR 技 术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下： 本产品在传统 AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发，
AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）具有下列特点：
1. 一站式，足够 50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和 1600 次 AFLP PCR（PCR 按 30 uL 体系计算），但不包括 DNA 纯化和带型分析试剂（如 PAGE 电泳试剂和 银染试剂）。
2. 本系列产品提供 EcoRI-MseI 组合，适用于 GC 含量在 50%以上的基因组。对 GC 含量在 50%以下的基因组，需从本公司采购 AFLP（EcoRI-TaqI）组合。
3. 各种参数都经过优化，一次 PCR 所得 AFLP 片段数一般在 10-100 之间，可重复 性好，误差小于 0.6%。4. 本产品适用于基因组在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物），对于基因组 在 50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid， BAC，YAC 和 PAC 等），需要分别另购专门的+1 型预扩引物混合液和+3 型 EcoRI 引物（8 种）AFLP 引物对。


运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 Southern 级 DNA 纯化试剂，尿素-PAGE 电泳套装，银染试剂盒。
AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）使用方法 一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）
用户需要自备 50-500ng Southern 级别的基因组 DNA，用前最好预实验以确保 DNA 能
够被 EcoRI 和 MseI 内切酶彻底切开。
二、 限制性酶切和接头连接反应（本试剂盒足够 50 次本反应）
1. 在 0.2 mL 离心管中加入设置 20 uL 的限制性内切酶酶切体系：
成分 用量
酶切-连接 Buffer，10× 2 uL
样品 DNA
50 ng（对小基因组材料）
500 ng（对大基因组材料）
如果用对照，则用 5uL
EcoR I-Mse I 酶混合液 2 uL
超纯水 加水到 20 uL
2. 轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温 2 小时酶切（若 PCR 仪器不带热盖，则必须加 50uL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同），70℃保温 15 分钟灭活内切酶。
3. 在上述酶反应体系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接头混合物和 1 uL T4 DNA 连接酶，轻柔混匀并短暂离心后，20℃保温 2 小时让接头跟 DNA 片段相连。
4. 在一个离心管中加入 10 uL 上步得到的连接反应液和 90uL TE 缓冲液，pH8，充分混匀，得到酶切-连接反应 10 倍稀释液，未用完的酶切-连接反应原液（30uL）可放-20℃保存。
三、 预扩增（本试剂盒足够 50 次本反应）
5. 在 0.2 mL 离心管中设置 30 uL 的 PCR 体系：
6. 离心数秒，按下列参数进行 PCR 预扩增：
温度 时间
94℃ 30S
PCR（20 次） 56℃ 60S
72℃ 60S
7. 可以取 10 uL PCR 产物在 1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物为 100-1500 bp 模糊条带。
8. 将剩下的预扩反应液用 TE 稀释 50 倍，直接用于下步反应或放-20℃保存待用。
四、选择性 PCR 扩增(本试剂盒足够至少 1600 次本反应)
9. 在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（如果用户已经知道哪个一种或几种引物组合适合自己的材料，则直接使用；如果不知道，则需要预先测试所有 64 种组合，设置 64 个 PCR反应），下面只是一种组合：
成分 体积
预扩反应液 50 倍稀释液
10. 轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行 PCR：
温度 时间
94℃ 30 秒
PCR（13 次） 65℃ 30 秒（每次循环递减 0.7℃）
72℃ 60 秒
94℃ 30 秒
PCR（23 次） 55℃ 30 秒
72℃ 60 秒
延伸 72℃ 5 分钟
五、尿素-PAGE 电泳和银染
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