3'RACE试剂盒

3'RACE试剂盒产品及特点 研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方
法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman
发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下，
利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 3′-端序列。本试剂
盒就是根据 3′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。
3′-RACE 的原理如下图：
规格及成分

成 分 编 号 10 次小扁盒包装
MMLV 逆转录酶-RI 混合物
（RNase H-，200 U/μL）
101104A 10 μL
MMLV Buffer（含 dNTP） 101104B 50 μL
PCR MagicMix 3.0 90805 1.5 mL
3′-RACE 引物 A（10 μM） Yw373 10 μL
3′-RACE 引物 B（10 μM） Yw374 100 μL
3′-RACE 引物 C（10 μM） Yw375 100 μL
RNase-Free 水 80403 1 mL
使用手册 101104sc 1 份
自备试剂 Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、基因专一性引物 B、超纯水。
运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。 
3'RACE试剂盒使用方法 一：利用含 Oligo(dT)的 3′-RACE 引物 A 进行逆转录
注意：MMLV 酶使用前必须短暂离心，因为它含 50%甘油，及其粘稠，否则将取不
到所需体积。
1. 在一个 PCR 管中，加入以下组分：
成分 用量
Poly(A) RNA（或总RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）
3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL
MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL
RNase-Free水 补至19 μL
合计 19 μL
注意：如果可能，最好使用Poly(A) RNA作为模板。
65℃保温 5 分钟，展开 RNA 的二级结构，立即冰浴待用。
2. 再在上述 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合物（200 U/μL）。
3. 37℃保温 60 分钟，42℃保温 30 分钟进行逆转录反应；然后 50℃保温 10 分
钟终止反应。
4. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀释上步得到的 cDNA，冰浴待用。长期放臵需要
放-20℃保存。
二：利用基因专一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 进行第一轮 PCR
5. 用不同量的 RT 反应液（稀释后的 cDNA）设臵 PCR（样品组最好设臵用量梯
度，单位：μL）。
成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4
稀释后的 cDNA 1 5 10 15
基因专一性引物 A（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5
3′ RACE 引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5
98℃ 5 分变性 RNA-cDNA 杂交链，短暂离心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0 25 25 25 25
RNase-free 水 19 15 10 5
合计 50 50 50 50
6. 按下列条件进行 PCR（注：应根据实际情况选择适当的退火温度）。
第 1 次循环：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合成第二链的 cDNA，
复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃
开始）。
第 2-30 次循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（此步为 PCR 扩增，
复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃
开始）。
最后延伸：72℃ 15 分
7. 取 5 μL 的 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认 PCR 扩增产物。若得到目
的扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可
按下列步骤进行巢式 PCR 反应。
三：利用基因专一性引物 B 和 3′ RACE 引物 C 进行巢式 PCR 反应
8. 将上轮 PCR 产物（4 管）均用水稀释稀释 20 倍，然后每管均用巢式 PCR 进行
扩增。巢式 PCR 反应设臵如下：
成分 用量
PCR MagicMix 3.0 25 μL
上步得到的PCR反应液（稀释20倍后） 1 μL
基因专一性引物 B（10 μM） 2.5 μL
3′ RACE 引物 C（10 μM） 2.5 μL
超纯水 补至 50 μL
9. PCR 反应。按下列条件进行 PCR：
第 1-30 次循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（复性温度需要根
据自备基因专一性引物 B 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃开始）
最后延伸：72℃ 15 分
10. 电泳检测。然后根据实验结果进行 DNA 测序或 TA 克隆。
注意事项
1. 如果两轮 PCR 得到的非特异产物多，可以在 RT 反应是继续降低 3′-RACE 引
物 A 的用量。
2. 自备的基因专一性引物的 GC 含量最好跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，
后者长度均为 18nt，均含 11 个 G（或 C），7 个 A（或 T）。
关联产品 5′-RACE 试剂盒（CAT#：101105）