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        AFLP分子标记实验

        互联网

        2030

        其基本原理是:以PCR(聚合酶链式反应)为基础,结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”,用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增),再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

        一、 实验材料
        采用青稞叶片提取总DNA。

        二、 实验设备
        1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,
        2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,
        3.美国MJ公司PCR仪,
        4.安玛西亚电泳仪等。

        三、 实验 试剂
        1. 试剂 :请使用高质量产品,推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。
        DNA提取试剂盒;
        EcoRI酶,MseI酶,T4连接酶试剂盒;
        Taq酶,dNTP, PCR reaction buffer;
        AFLP引物;
        琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;
        超纯水(18.2MΩ·cm)
        2.其他实验需要物品
        微量移液枪(一套)及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。

        四、 实验流程
        1、 总DNA提取
        使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。
        2、 EcoR1酶消化(20ul体系/样品)
        AFLP分子标记实验
        3、Mse1酶消化(20ul体系/样品)
        AFLP分子标记实验
        5、 预扩增(20ul体系/样品)
        sample 4ul
        Primer(Mse1/EcoR1) 1ul
        AFLP Core Mix 15ul
        ~undefined AFLP Core Mix 配方:
        ddH 2 O 13.8ul
        MgCl 2 1.6ul
        dNTPs(2.5mM) 1.6ul
        Taq酶(1U/ul) 1ul
        10×Buffer 2ul

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