糖基化位点

——即蛋白质药物的N糖基化位点分析技术服务

作为一种普遍存在的翻译后修饰，N糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，了解N糖基化修饰位点是理解蛋白质复杂多样生物功能的一个重要前提。ATP结合了蛋白质分子在溶液内的还原酶解、N糖基化肽段富集、H218O中脱糖以及高灵敏度的LC-MS检测，可对供试品的N糖基化修饰位点进行分析，明确供试品的N糖基化修饰位点，并提供相关的实验证据，包括多肽分子XICs质谱图、MS²谱图和数据分析结果等。

“抗体类药物的糖基化修饰情况是最重要的质量控制参数之一”
技术指标
本方法所检测的样品是蛋白质或多肽类供试品，测量的是N糖基化修饰的天冬酰胺所在多肽分子的分子量，测定的是该多肽分子的氨基酸序列。蛋白质或者多肽供试品既可以是固体样品，也可以是溶液样品。供试品的量应该不少于200μg，供试品如果为固体，应为蛋白质多肽冻干制品；如果供试品为液体，样品中蛋白质多肽浓度应尽可能在2mg/ml以上。
本方法检测是N糖基化修饰天冬酰胺位点和其所在多肽分子的氨基酸序列，被修饰的天冬酰胺所在序列需符合NXS/T结构（X为非脯氨酸）。质谱数据经软件MASCOT分析，鉴定肽段的significant P需小于0.05，且Mascot Score值需大于20。
N糖基化位点测定方法所使用的仪器：Thermo公司生产的高校液相串联质谱仪Q Exactive和Easy nLC1000。
案例分析
下图显示一个糖基化分析中糖基化肽段图谱（XIC of LC-MS/MS）。

图为糖基化分析中糖基化肽段图谱（XIC of LC-MS/MS）
下图为蛋白质类供试品下N糖基化位点分析的MS/MS图谱。

图为蛋白质类供试品糖基化位点分析的MS/MS图谱
Q&A

Item	Value
Type of Search	MS/MS Ion Search
Enzyme	Trypsin
Mass Values	Monoisotopic
Max Missed Cleavages	2
Variable Modifications	Carbamidomethyl (C), Oxidation (M), Deamidation 180(N)
Peptide Tolerance	20 ppm
MS2 Tolerance	0.1 Da
Fragmentation	HCD

本方法通过高度富集供试品中糖基化修饰肽段、高精度LC-MS/MS质谱检测以及严谨的质谱数据软件分析，其检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确。广泛适用于蛋白质供试品N糖基化修饰位点确证。

一般发生N-糖基化位点修饰的蛋白，都有基本的氨基酸结构骨架为：NXS或NXT的结构。为了鉴定N-糖基化修饰位点，首先用蛋白酶酶解蛋白质，再富集N-糖基化修饰肽段，最后用PNGase F糖苷酶在18O水中切除链接在ASN上的糖链。这样会使ASN分子量增加2.9890 Da。通过高精度LC-MS质谱检测脱糖后肽段，经MASCOT软件检索数据库（MASCOT是一种蛋白质鉴定软件，曾被Frost & Sullivan研究机构评为生物质谱软件的黄金标准），确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列，从而确定该蛋白质的糖基化位点。