细胞组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试

组织蛋白酶（CATHEPSIN），是一种木瓜酶（papain）类半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶体细胞器内，在酸性环境下激活，切离各种目标蛋白。根据其结构和底物特异性，组织蛋白酶家属约有十多种成员，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。组织蛋白酶在细胞内蛋白和细胞外蛋白通过内吞进行周转中起着重要作用，同时也是启动和传递细胞凋亡信号的替代机制，以及肿瘤和炎症性组织损伤的病理生理变化。其中组织蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又称为CTSB，作为溶酶体的标志性酶蛋白，可以使β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein）转化为β-淀粉样蛋白斑点（β-amyloid plaque）在抗原处理（antigen processing）、肿瘤转移、骨再吸收、细胞内或分泌性调节蛋白周转、卵细胞成熟、细胞凋亡等方面具有重要作用。细胞间接触和细胞外基质成分影响43kd组织蛋白酶原L转化为成熟蛋白。组织蛋白酶B使胶原蛋白、结缔组织蛋白、β-淀粉样前体蛋白等降解。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反应。组织蛋白酶B异常，将导致阿茨罕默综合症（Alzheimer's disease）、食道肿瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在组织蛋白酶L抑制剂Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到组织蛋白酶B的水解，释放出荧光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激发波长360nm；散发波长460nm），来定量测定组织蛋白酶B的特异活性。组织蛋白酶B反应系统为：


产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO标准液（Reagent E） 微升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent D）和HEPENGBIO标准液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
微型台式离心机：用于样品沉淀
培养箱：用于反应物孵育
96孔板或比色皿：用于样品荧光测定的容器
荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于样品荧光分析

实验步骤

• 样品制备

1. 1. 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
   2. 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
   3. 小心抽去清理液
   4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
   5. 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
   6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
   7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
   8. 小心抽去上清液
   9. 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀
   10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
   11. 强力涡旋震荡15秒
   12. 置于冰槽里孵育30分钟
   13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
   14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
   15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
   16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

1. 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液样品等），置于冰槽里
2. 设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长360nm，散发波长460nm，并置零
3. 准备好5个1.5