植物钙离子浓度荧光定量检测试剂盒

钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求。Fluo-4，一种与钙离子结合，其荧光强度迅速增强100倍的荧光探针，可以敏感测定微量游离钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长485nm，散发波长520nm，来定量测定植物组织细胞的钙浓度。

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO饱和液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent E） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent C）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
DOUNCE匀浆器：用于组织匀化
微型台式离心机：用于样品沉淀
培养箱：用于反应物孵育
黑色96孔板：用于样品荧光测定的容器
荧光酶标仪：用于样品荧光分析

实验步骤

• 样品准备

1. 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4. 即刻用刀片切碎组织
5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6. 加入预冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7. 涡旋震荡5秒，充分混匀
8. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
9. 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10. 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
11. （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12. 即刻移入到1.5毫升离心管
13. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
14. 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

• • • • 测定准备

1. 1. 准备好上述制备的待测样品，置于冰槽里备用
   2. 设定好荧光酶标仪（22℃）：激发波长485nm，散发波长520nm

三、荧光测定

1. 准备1个黑色96孔板，标记为：样品孔、空白对照孔、大对照空
2. 移取100微升（20微克蛋白）上述制备的样品到样品孔里
3. 移取xx微升HEPENGBIO饱和液（Reagent D）到大对照空里
4. 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）到空白对照空
5. 分别加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent C）到所有孔里
6. 轻轻摇动黑色96孔板，混匀
7. 室温下（22℃），孵育30分钟，避免光照
8. 即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）
9. 计算样品钙离子浓度（注意：不要遗忘乘上稀释倍数）

【（样品RFU－空白对照孔RFU）÷（大对照空RFU－样品RFU）】X 345 （纳摩尔；解离常数）
注意事项

1. 本产品为20次操作
2. 操作时，须戴手套
3. 避免使用EDTA等处理样品
4. 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
5. 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
6. 检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围
7. 样品浓度可以按照蛋白量或组织量定义
8. 本公司提供系列钙生化检测试剂产品