RIP实验（RNA结合蛋白免疫沉淀）

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列可通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

一、实验流程图



二、RIP实验流程
（一）. 细胞裂解液获取
A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管
3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞
4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min
5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃
B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解
C. 组织样品处理
1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次
2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数
3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞
4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min
5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃
（二）. 磁珠的准备
A. 实验前准备
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上
4、抗体，置于冰上
5、涡旋震荡器
6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水
B. 磁珠准备过程
1. 重悬磁珠
2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照
3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡
5.将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次
6.用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中
7. 室温孵育30min
8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清
9. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次
10. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上
（三）. RNA结合蛋白免疫沉淀
A. 准备工作
1、冰盒
2、360°旋转仪
3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程
1.准备RIP Immunoprecipitation Buffer
2.将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml
4. 4℃孵育3h至过夜
5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清
6. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次
（四）. RNA纯化
A. 实验前准备
1.枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇
4.DEPC水置于冰上
5. 离心机预冷
6. 冰盒
B. RNA纯化过程
1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
3. 55℃孵育30min
4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中
5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min
7. 小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管
8. 于每管加入400ul氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min
9. 小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管
10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇(无RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜
11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清
12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.
13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送测序或进行下游实验。