冰冻切片组织线粒体膜通道孔（MPTP）红色荧光（TMRM）检

冰冻切片组织线粒体膜通道孔（MPTP）荧光（TMRM）检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

冰冻切片组织线粒体膜通道孔（MPTP）荧光（TMRM）检测试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明甲酯染料，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，一旦释放到细胞浆，其荧光性显著降低，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻组织线粒体（动物、人体、昆虫等）膜通道孔活性的检测。产品严格无菌，即到即用，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。线粒体膜电位的去极化（depolarization），导致膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性，使之线粒体膨胀（swelling），内容物释放。其中钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失。四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），为罗丹明衍生物阳离子染料，作为电势测定（potentiometric）荧光探针：第一，具有亲脂性的； 第二，与线粒体内膜负电极结合而聚集；第三，容易进入细胞及其线粒体。四甲基罗丹明甲酯进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，被线粒体俘获，呈现强烈荧光。一旦线粒体膜通道孔开放，四甲基罗丹明释放出来而在胞浆重新分布，其荧光性显著降低。线粒体内荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀释液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制和组织细胞染色的容器
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于组织细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

1. 准备5片待测的厚为10微米的未经固着处理的冰冻切片
2. 置于室温下，小心加上xx微升预冷的清理液（Reagent A），铺满整个切片表面
3. 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
4. 小心加上xx微升室温预热的染色工作液，铺满整个切片表面
5. 在37℃湿润培养箱里，孵育30至60分钟（注意：避免液体蒸发）
6. 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
7. 小心加上xx微升清理液（Reagent A），铺满整个切片表面
8. 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
9. 重复实验步骤7和8一次
10. 放上盖玻片或封片
11. 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长540nm，散发波长580nm――红色荧光减弱，表明膜通道孔开放活性（MPTP）增强

注意事项

1. 本产品为50次操作
2. 操作时，避免污染母液
3. 操作时，须戴手套
4. 建议使用新鲜组织（手术切除后1小时内）制成的冰冻切片
5. 染色前，所有试剂溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃预热
6. 建议组织染色完成后，即刻进行荧光检测分析
7. 孵育时，必须避免光照
8. 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
9. 可以使用±10nm波长的滤波器
10. 本公司提供膜通道孔抑制剂： 0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－YD12226，维护荧光完整
11. 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。