动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒

动物硬组织线粒体粗提分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

动物硬组织线粒体粗提分离试剂是一种旨在从动物硬组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物硬组织（心脏或肌肉）的线粒体的制备。可以被用于细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品最佳。

技术背景

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
净化液（Reagent C） 毫升
强化液（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
酶解液（Reagent F） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存净化液（Reagent C）和酶解液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备操作的容器
1.5毫升离心管：用于保存线粒体的容器
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞





实验步骤

• 组织匀浆法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）
4. （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）
5. 即刻用刀片切碎组织
6. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
7. 加入预冷的xx毫升酶解液（Reagent F），充分混匀
8. 放进冰槽里孵育3分钟
9. 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
10. 小心抽去上清液
11. 加入预冷的xx毫升清理液（Reagent A）和xx毫升 净化液（Reagent C），充分混匀
12. 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
13. 小心抽去上清液
14. 加入预冷的xx毫升裂解工作液
15. 涡旋震荡5秒，充分混匀
16. 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
17. 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项7）
18. 将所有组织匀浆物移入预冷的15毫升锥形离心管
19. 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
20. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
21. 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
22. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）

23. （选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E）
24. （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
25. （选择步骤）小心抽去上清液
26. 加入xx毫升保存液（Reagent E），充分混匀
27. 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里保存

• 化学处理法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）
4. （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）
5. 移入到一个液氮冻存管
6. 即刻放进液氮罐过夜
7. 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
8. 放进一个15毫升锥形离心管
9. 加入预冷的xx毫升酶解液（Reagent F），充分混匀
10. 放进冰槽里孵育3分钟
11. 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
12. 小心抽去上清液
13. 加入预冷的xx毫升清理液（Reagent A）和2毫升 净化液（Reagent C），充分混匀
14. 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
15. 小心抽去上清液
16. 加入预冷的5毫升裂解工作液
17. 涡旋震荡5秒，充分混匀
18. 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
19. 加入预冷的xx微升强化液（Reagent D）
20. 涡旋震荡5秒，充分混匀
21. 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
22. 加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
23. 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
24. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
25. 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
26. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

（注意：如果进行线粒体DNA萃取，直接进入线粒体DNA萃取试剂盒的步骤4，继续下去）

27. （选择步骤）加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E）
28. （选择步骤）放入4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
29. （选择步骤）小心抽去上清液
30. 加入xx毫升保存液（Reagent E），充分混匀
31. 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里保存

注意事项

1. 本产品为10次（1克动物组织）或50次（200毫克动物组织）操作
2. 实际操作的动物组织重量与试剂用量成比例调整：例如200毫克动物组织，试剂用量是标准用量的五分之一
3. 所有操作均须严格在4℃或以下状态进行
4. 使用时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
5. 建议使用足够的样品量
6. 建议严格控制操作时间
7. 通常匀化次数为20至40下（或组织块状消失为止）达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。
8. 通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
9. 对于难以裂解的组织，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
10. 通常1克动物硬组织的线粒体含量为1至10毫克线粒体蛋白
11. 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
12. 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少
13. 如果需要获得95％以上纯度的线粒体，使用动物硬组织高质纯化线粒体分离试剂盒－GMS10006.4.3
14. 线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
15. 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
16. 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
17. 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3. 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4. 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。