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- 转基因果蝇
- 2025年07月30日
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果蝇转基因技术服务
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芳景生物
CRISPR KI(Point Mutation)
在CRISPR和donor(同源臂arm+点突变序列PM)的共同作用下，实现对目标靶点进行切割的同时，通过HR(同源重组)修复，将基因组DNA序列精确替换，造成目的氨基酸点突变。
技术优势：
◉优化了donor质粒序列的设计，在目标氨基酸两侧引入若干同义突变，提高了基因编辑和分子鉴定的效率，且不会对基因的表达和功能产生额外影响。
◉针对其他物种基因点突变表型研究，可通过制作黑腹果蝇同源基因的同位点突变模型来进行功能验证。芳景生物免费提供黑腹果蝇同源基因及对应位点分析服务。客户只需提供物种、基因、目标氨基酸位点等信息，我们即可全流程制作并获得目标点突变果蝇模型品系。
| CRISPR KI(point mutation) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
0 |
| donor质粒载体构建 | 1.arm载体构建：无缝克隆连接 载体：Amp抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor载体构建：无缝克隆连接 载体：arm载体PCR线性化，并引入目的点突变和gRNA识别位置点突变 3.Donor质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎数量：400-500个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1.P0果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置PCR鉴定 2.阳性P0的子代F1果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置PCR和测序鉴定 3.阳性F1的子代F2果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置PCR鉴定 4.阳性F2的子代F3果蝇自交构建稳定品系 5.F3的子代F4果蝇自交构建纯合品系，并进行点突变测序鉴定 |
8~10 |
| 合计 | 13~16 | |
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文献和实验. This is achieved by cotransfectingSpCas9 constructs (derived from pX330 or pX335)bearing guide sequences with a HR template in the target cellline. After recombination, modifi cations such as point mutation,small and large insertions/deletions, or other type
Nature：哈佛大学董民团队利用昆虫细胞全基因组 CRISPR 筛选，揭示杀虫毒素受体
。 与此同时，哈佛医学院 Norbert Perrimon 教授实验室于 2018 年开发了应用于果蝇 S2R+ 细胞全基因 CRISPR/Cas9 筛选的文库，利用整合酶介导的 gRNA 基因组定点整合的方法，不需要使用慢病毒转染。作者发现 pTc 毒素可以通过修饰细胞内肌动蛋白抑制 S2R+ 细胞分裂，但中毒 S2R+ 细胞基因组依然可以保持复制，进而导致中毒 S2R+ 细胞体积随着时间不断增大。 正是利用这一特征，在实际筛选中，作者巧妙地利用 30 微米孔径的细胞筛分离中毒细胞以及对毒素有耐性
突变一般指基因的变化，广义的突变还包括染色体畸变。所以突变并不包括由于分离和遗传重组所引起的变化。除了伴有明显的表型效应的突变（主要基因突变 major gene mutation）外，在数量性状（例如体重和果实的产量）突变中，常常发生应用统计分析的方法才能测出的微小的数量突变。这样的多基因突变（ polygene mutation）的出现频率在果蝇等生物中是非常高的。根据 DNA的变化的情况可将突变分类为如表所示的几类。涉及许多基因的突变可以被看作是染色
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