Nature：哈佛大学董民团队利用昆虫细胞全基因组 CRISPR 筛选，揭示杀虫毒素受体

细菌蛋白毒素是很多致病菌的主要武器，例如白喉毒素，炭疽毒素，肉毒杆菌毒素等等。近年来，全基因组 CRISPR/Cas9 筛选技术在哺乳动物细胞上得到广泛应用，成为研究这些针对人和动物的毒素和病原菌的主要实验方法。昆虫是地球上种类最繁多的动物，在整个生态链上起到至关重要的作用。在自然界中，存在许多专门靶向昆虫的细菌蛋白毒素， 有些已经被广泛地应用于农业害虫防治 。

现有的 CRISPR-Cas9 筛选技术依赖针对哺乳动物细胞的慢病毒转染系统，不适用在昆虫细胞上，大大限制了人们对针对昆虫的蛋白毒素作用机制，抗性，宿主特异性以及开发新型杀虫毒素等问题的研究。

2022 年 9 月 28 日，美国哈佛医学院波士顿儿童医院董民教授实验室、哈佛医学院 Norbert Perrimon 教授实验室以及德国马克斯·普朗克研究所 Stefan Raunser 教授实验室合作，在 Nature 期刊杂志发表了题为：CRISPR screens in Drosophila cells identify Vsg as a Tc toxin receptor 的研究论文。

该研究在昆虫细胞上首次利用 CRISPR-Cas9 筛选技术，找到了一种特异针对昆虫的细菌蛋白毒素（Tc toxin）的受体。这一工作在分子水平上揭示了毒素的作用机理和对不同昆虫的特异性，不仅建立了对这类毒素在自然界的功能的深刻理解，而且有助于将来进一步发展高效特异的生物杀虫剂，用来控制农业害虫和其他传播疾病的昆虫。

这项工作建立了在昆虫细胞上开展非病毒的全基因组 CRISPR-Cas9 筛选毒素受体的方法，为应用全基因组筛选这一关键技术来研究多种多样的针对昆虫的毒素，病原菌，病毒，众多虫媒病原菌和病毒，以及昆虫细胞生物学问题提供了开创性的榜样。

作者主要研究的是一种来源于昆虫病原线虫肠道共生菌的细菌毒素 Tc toxin。这种毒素有着非同寻常的生态角色：这类细菌寄生在土壤中的特定线虫体内，这些线虫专门寻找并入侵到土壤中的昆虫幼虫体内，然后释放出这些细菌到昆虫体腔内，这些细菌再用分泌的毒素来抑制昆虫的免疫反应，然后细菌大量繁殖，线虫再以细菌为食物，繁殖下一代，最终杀死昆虫。1998 年 R H ffrench-Constant 组首次报道从昆虫病原线虫共生菌，发光光杆状菌 (Photorhabdus luminescens) 中分离到活性蛋白毒素（Tc Toxin）。

为了更好的利用开发昆虫病原线虫这一重要的生物防治资源，人们一直对 Tc 毒素相关的分子机制的研究很感兴趣，并陆续在不同菌属细菌里发现了上千个 Tc 毒素家族成员，但却对其昆虫宿主因子知之甚少。

董民实验室发现 Tc toxin 家族的代表毒素（pTc）对多种人源细胞系毒性较低，而对果蝇 S2R+ 细胞毒性较高，5 pM 的毒素可以让 50% 的果蝇细胞呈现毒理表型，这暗示了果蝇 S2R+ 细胞表面很可能存在对 Tc 毒素高特异的受体。

与此同时，哈佛医学院 Norbert Perrimon 教授实验室于 2018 年开发了应用于果蝇 S2R+ 细胞全基因 CRISPR/Cas9 筛选的文库，利用整合酶介导的 gRNA 基因组定点整合的方法，不需要使用慢病毒转染。作者发现 pTc 毒素可以通过修饰细胞内肌动蛋白抑制 S2R+ 细胞分裂，但中毒 S2R+ 细胞基因组依然可以保持复制，进而导致中毒 S2R+ 细胞体积随着时间不断增大。 正是利用这一特征，在实际筛选中，作者巧妙地利用 30 微米孔径的细胞筛分离中毒细胞以及对毒素有耐性的细胞。通过几轮的富集和高通量测序， 最终鉴别出了一个单次跨膜的 Mucin 家族蛋白 Visgun，作为 pTc 毒素特异性受体。

图 1：Tc 毒素全基因组筛选

接着研究者进一步揭示了双翅目的埃及伊蚊，疟蚊以及鞘翅目的赤拟谷盗 Visgun 同源蛋白均可高效识别 pTc 毒素，而来源于鳞翅目的草地贪夜蛾和大腊螟 Visgun 同源蛋白则不能作为受体. 通过比对它们的蛋白序列，提示具有高度富集 O-glycan 修饰位点是不同昆虫物种 Visgun 同源蛋白能否作为 pTc 毒素受体的必要条件，有意思的是，人的同源蛋白 CD164 正好缺乏这一特征，这些发现在分子水平上解释了 Tc 毒素对宿主的选择特异性。

最后作者以果蝇作为昆虫宿主模型，发现 Visgun 蛋白主要在血细胞表达，而这些细胞正是昆虫的主要免疫系统。敲除 Visgun 蛋白可以降低原代血细胞对 pTc 毒素的敏感性，并且在被 pTc 毒素预处理后，这些血细胞依然保持吞噬细菌的能力。在被感染发光光杆状菌后, Visgun 蛋白敲除的果蝇也表现出较低的致死率和病原菌载量，这揭示出在病原菌感染的初期，低剂量的 Tc 毒素被分泌到昆虫体腔后，可以通过高特异性的 Visgun 受体进入昆虫血细胞，通过破坏昆虫免疫系统防线，为病原细菌的进一步整殖和最终杀死宿主创造条件。

图 2：敲除 Visgun 蛋白降低果蝇血细胞对 Tc 毒素的敏感度