
attP-PhiC31整合酶定点插入
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- 2025年07月29日
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果蝇转基因技术服务
- 提供商:
芳景生物
PhiC31定点插入转基因
PhiC31位点特异性整合酶来源于PhiC31噬菌体,它能介导位于噬菌体自身环状基因组上的attP (attachment-P) 位点,与位于变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)环状基因组上的attB (attachment-B)位点之间发生重组。利用这个原理,研究者最开始在细菌、酵母、和哺乳动物细胞中实现了,在PhiC31整合酶的催化下将包含attB位点序列的质粒整合到包含attP位点(或称为docking site,锚定位点)的基因组上。2014年Groth等人首次证明利用PhiC31整合系统,在果蝇细胞或胚胎中也能高效地实现转基因。这对于果蝇转基因技术,无论在效率和应用范围方面都是一次重要的升级。PhiC31定点插入相对于P因子随机插入转基因技术具有几个优势:1. 可选择转基因插入的位置;2. 可以将更大的片段整合到果蝇基因组;3. Recombineering,改造后的系统更便于研究。
果蝇中的PhiC31整合系统由3部分构成:(1) PhiC31整合酶;(2) attP果蝇品系;(3) 带有attB序列的注射质粒。PhiC31整合酶可通过注射外源PhiC31整合酶mRNA来提供,或者通过转基因将整合酶基因整合到果蝇基因组上,从而让胚胎自身表达提供整合酶。attP果蝇品系是通过转座子转基因技术(比如P因子, piggyBac, Mariner转座子),构建的带有attP位点的果蝇品系。attB质粒除了含attB位点,还被克隆上去了需要整合到基因组上的目的片段。这样,在PhiC31整合酶的催化下,注射质粒上的attB位点与基因组上的attP位点之间发生重组,从而将质粒上的序列完全整合到基因组上,并在序列两端形成新的杂合位点attL和attR,但attL与attR不能介导新的重组,因此PhiC31介导的转基因过程是不可逆的。
果蝇中的PhiC31整合系统由3部分构成:(1) PhiC31整合酶;(2) attP果蝇品系;(3) 带有attB序列的注射质粒。PhiC31整合酶可通过注射外源PhiC31整合酶mRNA来提供,或者通过转基因将整合酶基因整合到果蝇基因组上,从而让胚胎自身表达提供整合酶。attP果蝇品系是通过转座子转基因技术(比如P因子, piggyBac, Mariner转座子),构建的带有attP位点的果蝇品系。attB质粒除了含attB位点,还被克隆上去了需要整合到基因组上的目的片段。这样,在PhiC31整合酶的催化下,注射质粒上的attB位点与基因组上的attP位点之间发生重组,从而将质粒上的序列完全整合到基因组上,并在序列两端形成新的杂合位点attL和attR,但attL与attR不能介导新的重组,因此PhiC31介导的转基因过程是不可逆的。
多样化的attP果蝇品系:芳景提供多种有效的attP果蝇品系,涵盖X染色体和2号、3号染色体上的多个位点,便于进行基因重组。
◉推荐常用attP品系:attP40(II,25C6),attP2(III,68A4),效率高并且经过实验验证,被证明不影响插入位点附近的基因功能,且插入序列表型稳定。
◉推荐重组用attP品系:attP5(II,50F1),VK00005(III,75A10),适用于分别同attP40和attP2的定点插入品系进行重组构建,从而进行更复杂的课题研究。
广泛的科研应用场景:◉外源序列转入:可实现从简单到复杂序列的转入,一般推荐载体总长度小于15kb。
◉内、外源基因过表达:提供5~20×UAS,实现不同程度的基因过表达;提供多种泛表达和组织特异性表达的GAL4品系。
◉RNA干扰:单个shRNA针对单基因干扰研究多个shRNA串联,对多个基因进行共同干扰研究
◉基因调控研究定制化服务:除了GAL4-UAS系统,芳景生物也拥有其他多种基因调控研究的经验和方案可供选择,如:
- 生殖系统表达:UASp-K10;
- 二元调控系统备选方案:lexA-lexAop,QF-QUAS-QS;
- 诱导启动或抑制表达:GeneSwitch,GAL80;
- Split-GAL4:p65AD,GAL4DBD;
- 增强子表达模式研究:GMR-FlyLight,VT系列等。
如果客户希望将目的片段整合到特定的attP品系,可以将果蝇寄给我们进行扩增然后进行注射。另外,我们免费提供balancer杂交及鉴定服务(我们有FM7a,Bc/Cyo,TM3/TM6b等balancer品系),如果客户需要与指定的品系进行杂交,可提前将果蝇寄给我们进行扩增。
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