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- 2025年07月30日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
芳景生物
- 服务名称：
CRISPR KI
CRISPR KI(Tag)
通过CRISPR和donor质粒(同源臂+插入序列)的共同作用，实现对靶点进行切割的同时，通过HR介导的同源重组修复方式，精确插入外源序列的目的。多适用于内源基因N或C端插入标签基因(Tag)，以分析和获取该基因的表达模式。
提供两种技术方案，根据有无筛选标记(marker)区分：
| 无marker | 有marker | |
| 获得阳性方式 | 分子鉴定 | 表型筛选(眼睛的RFP) |
| 效率 | 略高 | 略低 |
| 筛选阳性通量 | 大部分F1代 | 全部F1代 |
| 成功率 | 较高 | 较高 |
| 编辑后序列 | 精确，无多余序列 | 移除后残留34bp的loxP |
| 周期 | 短 | 长(需要marker移除) |
| 价格 | 相对高(分子鉴定成本高) | 相对低(阳性筛选方便) |
| 适用范围 | 广泛 | 仅针对C端插入 |
| CRISPR KI-tag(with marker) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
0 |
| donor质粒载体构建 | 1.arm载体构建：无缝克隆连接 载体：Amp抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor载体构建：无缝克隆连接 载体：arm载体PCR线性化，并在gRNA识别位置引入点突变 片段：插入序列 + loxP-3P3-RFP-loxP marker(LRL) 3.Donor质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎数量：400-500个 |
2 |
| 杂交和筛选 | 1.P0果蝇与平衡子杂交 2.筛选F1阳性果蝇(3P3-RFP) |
2 |
| 分子鉴定 | 插入序列和基因组插入位置PCR和测序鉴定 | 0 |
| marker移除和构建稳定品系 | 1.F1阳性果蝇杂交平衡子 2.构建RFP稳定/纯合品系 3.F2果蝇与CRE内源表达品系杂交 4.子代F3挑选无RFP果蝇杂交平衡子，并进行PCR和测序鉴定确保RFP移除 5.构建marker移除的稳定/纯合品系 |
10~12 |
| 合计 | 18~21 |
| CRISPR KI-tag(without marker) | ||
| 实验步骤 | 内容 | 周期(周) |
| target测序 | 1.方法：PCR测序 2.目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保gRNA序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA和cas9-mRNA合成制备 | 1.gRNA设计：一个靶位点设计两个gRNA 2.gRNA合成：T7体外转录合成 3.cas9-mRNA合成：优化的cas9-DNA质粒为模板，体外转录合成cas9-mRNA |
0 |
| donor质粒载体构建 | 1.arm载体构建：无缝克隆连接 载体：Amp抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组DNA中克隆5'+3'同源臂 2.Donor载体构建：无缝克隆连接 载体：arm载体PCR线性化，并在gRNA识别位置引入点突变 片段：插入序列 3.Donor质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1.注射品系：w1118(或客户指定品系) 2.注射样品：gRNA+cas9-mRNA+donor 3.注射胚胎数量：400-500个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1.P0果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR鉴定 2.阳性P0的子代F1果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR和测序鉴定 3.阳性F1的子代F2果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置PCR鉴定 4.阳性F2的子代F3果蝇自交构建稳定/纯合品系 |
8~10 |
| 合计 | 14~17 |
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文献和实验Nature：哈佛大学董民团队利用昆虫细胞全基因组 CRISPR 筛选，揭示杀虫毒素受体
。 与此同时，哈佛医学院 Norbert Perrimon 教授实验室于 2018 年开发了应用于果蝇 S2R+ 细胞全基因 CRISPR/Cas9 筛选的文库，利用整合酶介导的 gRNA 基因组定点整合的方法，不需要使用慢病毒转染。作者发现 pTc 毒素可以通过修饰细胞内肌动蛋白抑制 S2R+ 细胞分裂，但中毒 S2R+ 细胞基因组依然可以保持复制，进而导致中毒 S2R+ 细胞体积随着时间不断增大。 正是利用这一特征，在实际筛选中，作者巧妙地利用 30 微米孔径的细胞筛分离中毒细胞以及对毒素有耐性
Basic Methods of Culturing Drosophila（培养果蝇基本方法）
. Writing the genotype on the vial or bottle at each transfer invites transcription errors and takes longer than moving a tag. Don"t use a stock center stock number or other potentially cryptic symbol as the only identifier of a stock. Stocks are often kept
【共享】Science：CRISPR热潮（中文翻译，附英文原文）
室也开始使用这种技术，对人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母细胞、线虫和多种农作物进行了大量的试验，成功地对基因进行了定向缺失、插入、活化或抑制等遗传改造操作，从各个方面证明了CRISPR技术的潜在应用价值。虽然生物学家们最近也开发出了几种新方法，可以对基因进行更加精确的操作，但是美国哈佛大学（HarvardUniversity）的 George Church认为，CRISPR技术的高效率和易用性还是其他技术无法匹敌的。Church的实验室是世界上首批使用CRISPR技术成功对人类细胞进行遗传
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