E. coli DNA 连接酶

♦   Okayama 和 Berg 用于 cDNA 克隆（3）

催化双链 DNA 粘性末端的 5´-磷酸和 3´-羟基形成磷酸二酯键。

按照 Panasenko et al.（2）的方法，纯化自重组 E.coli 594（su-）菌株，该菌株携带有噬菌体 λgt4 lop 11 lig + Sam 7（1）。

1X E. coli DNA 连接酶缓冲液 [30 mM Tris-HCl（pH 8.0），4 mM MgCl₂ ，1 mM DTT，26 μM NAD⁺ ，50 μg/ml BSA]。最适反应温度为16 ℃。

无核酸内切酶和外切酶活性污染。

1 单位指在 20 μl 反应体系中，在 16 ℃反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 HindIII 消化的 λDNA 片段 [5' 端浓度为 0.12 μM （300 μg/ml）] 连接所需的酶量。

1X E.coli DNA 连接酶缓冲液和 λ DNA/HindIII 消化片段(300 μg /ml)。

10,000 units/ml。

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μg /ml BSA 和 50% 甘油。      -20°C 贮存。

65°C 20分钟。

与 rATP 作辅因子的其它连接酶不同，本酶要求NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作辅因子。

该酶对平齐末端片段的连接效率极低，平齐末端的连接请用 T4 DNA 连接酶。

不要用于将 RNA 连接至 DNA（4）。

(1) Panasenko, S.M. et al. (1977) Science , 196, 188–189.
(2) Panasenko, S.M. et al. (1978) J. Biol. Chem ., 253,4590–4592.
(3) Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol .,2, 161–170.
(4) Higgins, N.P. and Cozzarelli, N.R. (1979). In R.Wu (Ed.), Methods in Enzymology , Vol.68, (pp. 50–71). New York: Academic Press.