AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡检

CA1040 AnnexinV Alexa Fluor488/PI 凋亡检测试剂盒

产品简介：
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是 完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用Annexin V与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤:
1、细胞样品的准备：
a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约 1ml 4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
2、用去离子水按 1:3 稀释结合缓冲液(4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水)；
3、用 1x 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5×106/ml；
4、取 100µl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混匀后于室温避光孵育 5 分钟；
5、加入 10µl 20ug/ml 的碘化丙锭溶液(PI)，并加 400µl PBS，立刻进行流式检测。

实验设计：
1、空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压；
2、单染管：阳性对照组细胞，只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于调节补偿；
3、检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

注意事项：
1、Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，PS 由脂膜内侧翻向外侧；
2、低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2～3 次，离心机 4℃1000rpm 5min 离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在 5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3、先加PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI 本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做；
4、Annexin V 是Ca 依赖的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V，进而影响结果。
5、用流式检测凋亡时，PI 受时间的影响很大，因标记了 PI 后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致 PI 的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般 PI 加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。

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