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        AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测protocol

        互联网

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        annexinV-FITC(FL1 通道)+ PI(FL2通道)双染细胞,FITC阳性+PI阴性细胞百%就是早期凋亡%。

        一、原理

        磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素(FITC、PE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

        碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

        二、方法

        1、调整待检测细胞浓度为106个/ml,取200ul, 1000rpm×5min(4℃)。

        2、预冷的PBS1ml 润洗两次2,1000rpm×5min(4℃)。

        3、将细胞重悬于100ul binding buffer,加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml),轻轻混匀,避光冰上放置15分钟。

        4、转至流式检测管,加入400ulPBS,每个样品临上机前加入1ulPI(50ug/ml),2分钟后迅速检测。

        5、同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。

        三、注意事项

        1、整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。

        2、操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测

        四、结果判定

        以AnnexinV为横轴,PI为纵轴;

        左上象限为机械性损伤细胞;

        右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞;

        左下为阴性正常细胞;

        右下为早期凋亡细胞。

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